抗真菌药物高通量筛选，国际通用oCelloScope方法
一 实验目的
1 遵循CLSI M27、ISO 16256国际抗真菌药敏试验通用标准，依托丹麦BioSense oCelloScope系统建立标准化、可全球通用的抗真菌药物高通量筛选方法，替代传统微量肉汤稀释终点判读法，实现动力学全程定量检测。
2 利用设备FluidScope液体多层堆栈成像技术，高通量同步完成化合物库、单体提取物、复方制剂对酵母菌、丝状真菌的抑菌活性初筛，自动判定最低抑菌浓度MIC、萌发延滞期、菌丝形态损伤等多重药效指标。
3 解决传统OD浊度法灵敏度不足、无法区分抑菌与畸形假生长、只能终点读数的缺陷，通过时序成像直观呈现药物对孢子萌发、芽管延伸、菌丝分枝、菌丝球形成的抑制表型，形成可被国际期刊与药敏实验室认可的规范操作体系。
4 搭建96孔板单批次多菌株、多药物浓度梯度、多重复并行筛选体系，实现长时间无人值守自动化监测，提升新药筛选通量与数据重复性。
二 实验前期材料、仪器与前期准备
1 受试菌株与标准化菌悬液制备（符合国际药敏接种量规范）
酵母菌（白色念珠菌、光滑念珠菌等）采用YPD固体培养基30℃培养48h，挑取单菌落用无菌生理盐水调至0.5麦氏浊度，再梯度稀释至终浓度1×10³ CFU/mL。
丝状真菌（曲霉、镰刀菌、青霉等）PDA平板25～28℃培养7d产孢，0.05%吐温80无菌生理盐水洗脱孢子，四层纱布过滤去除菌丝碎片，血球计数板计数后稀释为1×10³～1×10⁴ CFU/mL，该接种密度为oCelloScope国际通用推荐浓度，可保证单细胞/单孢子独立追踪成像。
菌悬液置于冰浴环境，30分钟内完成加板，避免提前启动萌发导致延滞期数据失真。
2 培养基、药物梯度与对照组设置（国际通用肉汤体系）
酵母菌使用RPMI 1640液体培养基，丝状真菌使用RPMI 1640或PDB液体培养基，调节pH至7.0，121℃高压灭菌20min，冷却备用，全程纯液体培养，不添加琼脂。
受试药物采用二倍倍比梯度稀释，溶剂为DMSO或无菌水，母液经0.22μm滤器除菌，孔内终溶剂浓度不超过1%，排除溶剂本身抑菌干扰。
按照国际药敏试验要求设置全套对照组：无菌培养基空白对照组、溶剂对照组、真菌正常生长阳性对照组、已知阳性抗真菌药物质控对照组（氟康唑、卡泊芬净、伏立康唑等）。
单孔终体积统一设定100μL，适配设备96孔扫描参数。
3 oCelloScope仪器硬件与UniExplorer软件国际标准参数预设
主机放入恒温培养箱提前预热2h，执行光路灰度校准、空白培养基基线校正，消除培养基杂质、药物析出颗粒背景干扰。
软件新建高通量药敏筛选任务，丝状真菌选择FluidScope液体深层扫描模式，酵母菌选择常规透射扫描模式，强制开启SESA静态杂质过滤算法，剔除结晶、沉淀假阳性信号。
Z轴扫描步长固定10μm，覆盖微孔底部至液面全部深度；全板扫描时长控制在3分钟以内；时序拍摄间隔设定为30min/次，总监测时长酵母菌24h、丝状真菌72～168h，满足国际标准所需完整生长周期。
软件预设BCA总吸收算法计算菌丝/菌体累积面积，自动拟合生长动力学曲线、计算AUC曲线下面积、萌发延滞时间、最大生长速率，开启形态学参数自动量化模块，用于判断药物诱导菌丝肿胀、扭曲、断裂等损伤表型。
培养温度严格按照菌株国际培养标准设定，酵母菌35℃，霉菌25～28℃，箱体温度波动控制±0.5℃以内。
4 耗材与高通量排布规范
采用无菌平底96孔聚苯乙烯微孔板，最外圈所有孔填充对应液体培养基作为蒸发补偿孔，防止边缘孔液体挥发造成渗透压改变影响药敏结果。
每个药物浓度梯度、每株真菌设置不少于4个生物学复孔，96孔板可一次性排布10组以上药物梯度+多菌株平行筛选，符合高通量药物筛选布局逻辑。
三 实验操作
1 超净台无菌加样与板前预处理
全程在二级生物安全柜内无菌操作，固定加样顺序：液体培养基→梯度药物工作液→标准化真菌菌悬液，避免药物直接接触菌体造成局部浓度冲击。
加样完成后微孔板水平放置，300g低速离心1min，使孢子或酵母细胞均匀沉降至孔底，同时彻底排出孔内微小气泡，防止气泡遮挡扫描光路造成成像缺失。
使用透气疏水封板膜密封整块板，既保证有氧代谢气体交换，又减少长期培养水汽冷凝滴落污染，封板后室温避光静置60min，等待菌体完全沉降稳定后上机。
2 板体装载与高通量筛选任务启动
将密封完成的96孔板平稳卡入设备专用板架，扣紧卡扣防止长时间时序扫描过程板体位移偏移，保证图像堆栈对齐。
在UniExplorer软件内选择对应96孔板型号，录入菌株编号、药物名称、浓度梯度、培养温度、扫描间隔、监测总时长等实验信息，勾选图像堆栈存储、动力学自动分析、MIC自动判定、形态学参数导出全部模块，核对参数与国际通用试验要求一致后，启动全自动无人值守时序扫描。
整个监测周期无需开盖、无需人工干预，仪器按照设定间隔自动完成逐层成像与像素量化分析。
3 实验终止、数据导出与结果判定（国际通用判定逻辑）
预设监测周期结束后，在软件端终止运行任务，取出微孔板进行高压灭菌无害化处理，真菌废弃物按生物危害垃圾规范处置。
第一部分导出定量药敏数据：系统依据生长曲线抑制率自动给出各药物对菌株的MIC值、生长抑制AUC、萌发延滞延长比例、最大生长抑制速率，可直接对标CLSI肉汤稀释法判定标准。
第二部分导出原始成像数据：各时间点原位聚焦图片、Z轴三维堆叠重建图像，用于佐证低浓度药物仅延迟萌发、高浓度直接阻断芽管伸出、亚抑菌浓度导致菌丝畸形等表型，作为药效机制补充证据。
所有工程源文件、数值表格、时序影像本地完整备份，满足论文投稿与方法学溯源要求。
4 方法学验证平行操作（可选，国际文章必备）
选用标准质控菌株重复整套梯度筛选实验，保持培养基、接种量、仪器扫描参数完全一致，验证MIC结果重复性；同时采用CLSI标准微量肉汤稀释法做平行比对，确认oCelloScope成像法与国际参考方法结果相关性，提升方法认可度。
四 国际通用药效判定指标与质控标准
1 核心定量药敏指标
最低抑菌浓度MIC，定义为完全抑制真菌可见生长的最低药物浓度，由软件基于菌丝累积面积曲线自动判定；生长曲线下面积AUC抑制率，量化药物整体抑制强度；孢子萌发延滞期延长时长，评价药物对休眠孢子激活的阻滞作用。
2 形态学辅助判定指标
丝状真菌芽管长度、分枝数量、菌丝球直径、异常菌丝占比；酵母菌出芽抑制率、细胞膨大畸形比例，用于区分杀菌效应与单纯生长抑制效应。
3 数据有效性国际质控规则
空白对照组全程无真菌生长像素信号；阳性对照组菌株生长动力学曲线正常上升；平行复孔MIC结果完全一致，动力学数值相对偏差小于5%；质控药物MIC落在国际标准菌株允许误差区间内，方可判定本次高通量筛选数据有效。
五 实验质控关键点与注意事项
1 接种量严格标准化
菌悬液浓度偏差会直接导致MIC漂移，必须严格按照CLSI规定浊度/孢子数进行稀释，每批次都做计数复核，这是方法国际通用性的核心前提。
2 溶剂与药物析出干扰控制
脂溶性药物易在RPMI培养基中析出微小颗粒，必须设置溶剂空白孔，依靠SESA过滤算法剔除杂质信号，避免系统将结晶误判为真菌生长造成MIC假性偏高。
3 扫描频率不低于30分钟间隔
高频扫描才能捕捉早期萌发延滞期抑制效果，符合oCelloScope国际发表文献通用设置，间隔过大会丢失早期药效动力学数据。
4 蒸发与氧环境管控
必须使用透气封板膜+外圈补偿孔，密闭缺氧环境会造成真菌生长自发抑制，导致药物筛选假阳性结果，违背肉汤微量稀释法国际培养条件要求。