狂犬病毒G蛋白基因实时荧光定量PCR检测方法——清晰反映病毒生长曲线
在人用狂犬疫苗的生产过程中，病毒液的收获是关键工序之一。传统方法是将狂犬病毒接种至Vero细胞后，定期收集细胞上清液，利用针对狂犬病毒G蛋白的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒检测G蛋白含量。通过监测病毒收获液中G蛋白含量的变化，确定病毒增殖的动态及最佳收获时间点。
本文研发了一种狂犬病毒G蛋白基因特异性实时荧光定量PCR检测引物探针组、检测试剂盒和检测方法。引物探针组包括狂犬病毒G蛋白的一对特异性序列设计的引物及相应的一条探针,同时包含基于该引物探针组合构建的qPCR检测方法。通过该方法，可定量检测狂犬疫苗生产过程中病毒收获液中的G蛋白基因拷贝数，从而精准监控病毒增殖动态、清晰反映病毒生长曲线，实现对狂犬病毒的快速、准确检测。相较于传统ELISA方法，此方法具有成本低、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，有效提升疫苗生产效率；此外，该方法能为疫苗生产工艺关键参数(如病毒液最佳收获时间)的优化提供可靠数据支撑。
一、引言：疫苗生产中病毒检测的技术困境
人用狂犬疫苗的生产过程中，病毒液的收获是关键工序。传统做法是将狂犬病毒接种至Vero细胞后，定期收集细胞上清液，利用针对狂犬病毒G蛋白的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测G蛋白含量，据此判断病毒增殖动态并确定最佳收获时间点。《中国药典》2020年版三部中“狂犬病疫苗（Vero细胞）”项下明确规定采用ELISA法检测G蛋白含量，该方法是法定检测手段，但存在试剂盒成本高、单次检测消耗试剂量大的问题。长期应用导致疫苗生产成本居高不下，限制了工艺的经济性和可持续性。
实时荧光定量PCR（qPCR）技术作为分子生物学领域成熟的定量检测手段，利用荧光共振能量转移现象，通过监测PCR循环中荧光强度变化实现模板定量，相较于普通PCR具有特异性高、操作步骤简化、减少错配的优势，检测周期可缩短至1-2小时。然而，现有技术中尚未见针对狂犬病毒G蛋白G-CTN基因（Genbank登录号：FJ959397.1）设计特异性引物探针，并将qPCR技术应用于狂犬疫苗生产过程中病毒增殖动态监测的相关报道。部分涉及狂犬病毒qPCR检测的技术，如专利CN202410905219.X聚焦于N基因，用于活病毒快速检测及灭活后残留活病毒检测；专利CN101565758B仅针对血液制品中狂犬病毒污染筛查，均非疫苗生产场景下的病毒滴度定量及收获时间优化。
因此，开发一种高灵敏度、高特异性、低成本的qPCR检测方法，直接服务于狂犬疫苗生产工艺优化，具有重要的产业价值。
二、靶基因选择与引物探针设计
2.1 靶基因的确定
经大量文献调研与靶基因筛选分析，本研究选择狂犬病毒G蛋白基因组中高度保守且具有种属特异性的靶基因G-CTN（Genbank登录号：FJ959397.1）作为检测靶标。该基因的保守性可保障检测特异性，避免与其他病毒或细胞杂质产生交叉反应；种属特异性则确保检测结果仅指向狂犬病毒，排除假阳性干扰。
2.2 引物探针序列
使用Primer Premier 5.0在线引物设计软件，针对G-CTN基因设计荧光定量PCR检测用引物及相应探针。综合考虑扩增产物大小、退火温度、GC含量、引物间及引物与探针间的Tm差值、二聚体形成等因素，经大量实验验证筛选出最优组合。引物和探针由北京擎科生物科技股份有限公司合成，具体序列如下：
| 靶向基因 | 引物名称 | 序列(5’-3’) | 序列表中编号 |
| G-CTN | G-CTN-F | CAGACTTAGACCCGTACGATAAATCAC | SEQ ID NO.1 |
| G-CTN | G-CTN-R | GTTGGTAGAGCAGTAGGCAGAAG | SEQ ID NO.2 |
| G-CTN | G-CTN-P | ACCGTTATTCCTGAGCAT | SEQ ID NO.3 |
探针G-CTN-P两端采用荧光基团-淬灭基团双标记，与扩增片段的中间部分序列同源。荧光基团为FAM，淬灭基团为NFQ-MGB。
三、qPCR检测方法的建立与验证
3.1 标准质粒的制备与DNA灵敏度检测
将G-CTN标准质粒委托合成，测得浓度约为9.911 ng/μL，拷贝数为3.23×10⁹ copies/μL。依次用ddH₂O稀释至99.11 pg/μL、9.911 pg/μL、0.9911 pg/μL、0.09911 pg/μL、0.009911 pg/μL、0.0009911 pg/μL，作为6个已知浓度的DNA反应样品。配制20 μL反应体系：2×T5 Fast qPCR Mix（probe）10 μL，正向引物G-CTN-F（10 μM）0.7 μL，反向引物G-CTN-R（10 μM）0.7 μL，探针G-CTN-P（10 μM）0.6 μL，DNA模板1 μL，ddH₂O补足至20 μL。反应程序：95℃预变性2分钟（1个循环）；95℃变性15秒、60℃退火延伸30秒（40个循环）；衍生后采集FAM荧光。
结果显示，扩增曲线线性良好，标准曲线相关系数R²=0.999，扩增效率E=90.3%，符合qPCR检测要求。最低浓度0.0009911 pg/μL仍可检出阳性扩增，表明该方法的DNA检测灵敏度至少可达0.0009911 pg/μL，远高于常规标准要求。
3.2 cDNA模板的建立与病毒抗原灵敏度检测
取狂犬病毒标准品（病毒滴度8.875 IU/mL），依次用ddH₂O进行梯度稀释（原液、10倍、100倍、1000倍、10000倍）。按照试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA。以cDNA为模板，采用相同反应体系与程序进行qPCR检测。
5个稀释梯度的cDNA样品均出现阳性扩增，标准曲线R²=0.9989，扩增效率E=95%，处于qPCR理想效率范围（90%-110%）。最低可检测抗原含量为8.875×10⁻⁵ IU/mL，表明该方法具有极高的病毒抗原检测灵敏度，可有效避免假阴性。
3.3 特异性验证
用EASY Dilution将甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒BV基因组cDNA稀释至不低于50 pg/μL的浓度，取1 μL作为模板加入反应体系。同时设置胎牛血清、MEM培养基作为对照。结果显示，所有非狂犬病毒样本均无扩增阳性结果（见表2），表明该引物探针组合对狂犬病毒G-CTN基因具有高度特异性，不会与常见细胞培养成分或其他呼吸道病毒发生交叉反应。
表2 特异性验证实验结果
样品类型 检测结果
胎牛血清 -（未检出）
MEM培养基 -（未检出）
甲型流感病毒H1N1 cDNA -（未检出）
乙型流感病毒BV cDNA -（未检出）
四、qPCR方法在疫苗生产中的应用
4.1 病毒培养液制备与标准曲线构建
将狂犬病毒（CTN-1株）接种Vero细胞，取灌流培养过程中的病毒收获液。狂犬病毒标准品（8.875 IU/mL）依次用ddH₂O稀释至原倍、4倍、16倍、64倍、256倍、1024倍、4096倍、16384倍。提取RNA并反转录为cDNA，进行qPCR检测。
7个稀释梯度的标准样品均出现阳性扩增，标准曲线R²=0.9938，扩增效率E=97%，处于理想范围。表明该方法在不同病毒浓度范围内均具有稳定的定量能力。
4.2 实际样本检测与ELISA对比
取3份病毒培养液样本，提取RNA反转录后，将Ct值代入标准曲线计算病毒滴度。结果显示，qPCR检测结果与传统ELISA方法（狂犬病疫苗效力抗原检测试剂盒）的结果高度吻合，证实该方法可实际用于疫苗生产中最佳收获时间的确定。
五、病毒生长动态监测的革新：丹麦Biosense oCelloScope系统
尽管上述qPCR方法在灵敏度和特异性上表现优异，但其本质仍是一种终点检测技术——需要采样、提取核酸、反转录、扩增，整个过程约1-2小时，且只能提供单个时间点的病毒基因拷贝数。对于疫苗生产过程中病毒增殖动态的实时监测，尤其是确定最佳收获时间点这一核心需求，理想的解决方案应具备连续、非侵入、实时的特性。
丹麦Biosense公司推出的oCelloScope微生物生长动态监测系统正是为此而生。该系统基于光学散射原理与自动化显微成像，可对培养瓶或多孔板内的细胞-病毒体系进行连续扫描，实时获取细胞病变效应（CPE）或病毒诱导的细胞形态变化数据，无需取样、无需标记、无需破坏培养环境。
在狂犬病毒培养场景中，oCelloScope可置于CO₂培养箱内，每隔设定时间（如15-30分钟）自动采集一次明场图像，通过内置算法分析Vero细胞单层的融合度、空斑形成或细胞脱落程度，从而间接反映病毒的增殖动力学。与传统ELISA或qPCR相比，其优势在于：
• 实时性：提供连续的病毒生长曲线，而非离散时间点数据；
• 非侵入性：无需频繁取样，降低污染风险，减少培养体积损失；
• 高通量：可同时监测多个培养条件（如不同MOI、不同培养基配方），加速工艺优化；
• 数据连续性：可精确捕捉病毒对数生长期的起始点和平台期，为确定最佳收获时间提供更可靠的依据。
结合本文建立的qPCR方法，可形成一套“宏观-微观”互补的检测策略：oCelloScope提供实时生长动态曲线，用于初步判断收获窗口；qPCR则在关键时间点（如对数中期、平台前期）对病毒G蛋白基因拷贝数进行精确定量，验证并校准oCelloScope的判读结果。这种双重验证体系不仅能显著降低ELISA带来的高成本，还能提升工艺控制的精细度。
六、结论
本研究成功建立了一种基于狂犬病毒G蛋白G-CTN基因的实时荧光定量PCR检测方法，设计了特异性引物探针组，优化了反应体系与程序。该方法DNA检测灵敏度达0.0009911 pg/μL，病毒抗原检测灵敏度达8.875×10⁻⁵ IU/mL，特异性良好，与甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒BV等无交叉反应。在实际疫苗生产样本检测中，qPCR结果与ELISA高度吻合，可替代传统ELISA用于病毒收获液滴度测定。
进一步结合丹麦Biosense oCelloScope系统，可实现病毒增殖动态的实时、非侵入式监测，为确定最佳收获时间点提供连续数据支撑。该整合方案在降低检测成本、缩短检测周期、提升工艺可控性方面具有显著优势，有望成为狂犬疫苗生产过程中病毒检测与工艺优化的标准化工具。
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