黄嘌呤氧化酶-乳过氧化物酶系统对婴儿口腔细菌生长曲线、抗菌活性及基因表达谱分析
3. 结果
3.1 乳过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶的分离
为评估XO和LPO的潜在抗菌作用，按照第2.1节所述分离乳酶。对于LPO分离，将全脂牛奶离心获得的脱脂牛奶酸化以从酪蛋白部分分离乳清。对酸性乳清组分进行硫酸铵蛋白沉淀，随后透析，然后将样品进行离子交换色谱。对分离过程中选定组分进行SDS-PAGE（图2A）以及对最终分离物进行蛋白质印迹分析（图2B）。从12升牛奶的乳清组分中，共分离出138 mg LPO，浓度为2.38 mg mL⁻¹。基于SDS-PAGE和0.50的A₄₁₂/A₂₈₀比值，认为LPO分离成功，尽管存在少量污染物。
图2. 乳过氧化物酶（LPO）的分离。（A）LPO分离过程中选定组分的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，从酸性乳清开始，经过二乙氨基乙基（DEAE）Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，到最终LPO分离物。（B）对分离的LPO进行蛋白质印迹分析。
LPO分离程序概述见表2。根据酶活性测量，LPO从酸性乳清中纯化了447.7倍，产率为29.1%。我们之前研究中的XO分离物纯化了484.7倍，产率为6.8%。总之，LPO和XO分离物均被认为适合用于测试两种酶的抗菌作用。
表2 从牛乳中分离乳过氧化物酶（LPO）的步骤。测量蛋白质数量和酶活性，并通过酶活性评估纯化。DEAE：二乙氨基乙基。
| 纯化步骤 | 总体积（毫升） | 活性（单位/毫升） | 总活性（单位） | 蛋白质（毫克/毫升） | 总蛋白质（毫克） | 比活（单位/毫克） | 产率（%） | 纯化倍数 |
| 酸性乳清 | 9000 | 0.03±2E-3 | 282.1±20.2 | 19.5±3.9 | 175770.0±35126.1 | 0.002 | 100 | 1 |
| DEAE上样液 | 2290 | 0.12±0.04 | 276.1±92.1 | 35.3±2.3 | 80905.7±5234.7 | 0.006 | 97.9 | 3.7 |
| DEAE流穿液 | 3083 | 0.07±5E-3 | 199.1±15.3 | 0.9±0.1 | 2651.4±169.8 | 0.063 | 70.6 | 41.7 |
| 纯化的LPO | 258 | 1.41±0.24 | 82.0±14.8 | 2.4±0.2 | 138.0±9.5 | 0.680 | 29.1 | 447.7 |
* LPO活性以每分钟形成的氧化TMB产物的微摩尔量（U）归一化至1 mL样品来评估。数据表示为每个样品三种不同浓度的平均值（n=9）。
3.2 使用oCelloScope进行细菌生长试验
使用自动成像系统（oCelloScope）评估了不同浓度的LPO以及LPO与XO联合对从婴儿口腔培养的细菌的影响。生长曲线数据转换为最大平均生长速率（表3）。添加LPO（单独或与XO联合）显示出剂量依赖性抗菌作用（图3）。在较低浓度（40–80 μg mL⁻¹）时，酶引起滞后期轻微延长和生长速率小幅降低。在中等浓度（100–160 μg mL⁻¹）时，滞后期显著延长且生长速率明显降低。在最高测试浓度（200 μg mL⁻¹）时，细菌生长被完全抑制。总之，LPO无论是否与XO联合，均以剂量依赖性方式对细菌生长表现出强抑制作用。
表3 乳过氧化物酶（LPO）和LPO与黄嘌呤氧化酶（XO）联合对从婴儿口腔培养的细菌生长的影响。
| 牛奶酶浓度（μg/mL） | 最大平均生长速率（生长量/小时） | |||||||
| 0 | 40 | 60 | 80 | 100 | 120 | 160 | 200 | |
| LPO | 1.97 | 1.93 | 1.66 | 1.64 | 1.32 | 1.27 | 1.26 | 0.14 |
| XO+LPO | 1.97 | 1.82 | 1.73 | 1.45 | 1.48 | 1.36 | 0.92 | 0.09 |
* 最大平均生长按每种条件下最大五次增长的平均值计算（n=3）。
图3. 添加乳过氧化物酶（LPO）（A）或黄嘌呤氧化酶（XO）与LPO联合（B）的细菌生长曲线。显示了乳酶（0–200 μg mL⁻¹）对从婴儿口腔过夜培养的细菌生长的剂量依赖性抗菌作用。使用oCelloScope每15分钟监测37 °C下的细菌生长24小时。数据表示为平均值。
3.3 乳组分对细菌组成的影响
从五名婴儿口腔采集的细菌合并后，于37 °C和180 RPM下在BHI培养基中孵育24小时。将悬液稀释至1%，并于37 °C和180 RPM下孵育2小时以达到对数生长期。从此悬液（称为储备液）进行细菌实验，如第2.6节所述。
扩增子测序从本研究使用的12个样品的16S rRNA V1-V8区域共产生1,315,127条原始读段。序列经过严格的质量和大小过滤（1200–1600 bp，≥Q23），产生556,429条读段，中位读段长度为1409 bp，读段质量为25.2。这些读段聚类为4,918个操作分类单元（OTU）（表4）。表示高质量读段数量与观察到的OTU数量关系的稀疏曲线和主成分分析（PCA）分别见补充图S1和图S2。
表4 DNA测序分析中的乳组分、样品数量、过滤后序列总数和操作分类单元（OTU）总数。LPO：乳过氧化物酶，XO：黄嘌呤氧化酶。
| 牛奶组分 | 生物学样本数 | 过滤后序列总数 | 操作分类单元总数 |
| 原液 | 2 | 82,916 | 1,162 |
| LPO | 2 | 145,783 | 1,282 |
| XO+LPO | 4 | 193,834 | 1,285 |
| 对照 | 4 | 133,896 | 1,956 |
* 由于储备液仅发现一个生物学样品，此数字指技术重复。
对所有样品中OTU的分析主要聚类于两个主要门：厚壁菌门和变形菌门，其他门的相对丰度低于1%。所有样品的属水平谱显示芽孢杆菌属、γ-变形菌纲、萨特氏菌属和葡萄球菌属占主导；其他属的相对丰度低于1%，包括罗氏菌属、链球菌属和奈瑟菌属。芽孢杆菌属是所有样品中最主要的属，占OTU的80.5–96.1%，表明即使短期孵育也促进了向单培养的转变（补充图S3）。
3.4 乳过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶对细菌基因表达的影响
为进行纳米孔直接cDNA测序，制备了两组培养的口腔细菌。一组用黄嘌呤氧化酶（80 μg/mL）和乳过氧化物酶（80 μg/mL）的组合处理约4小时，另一组作为未处理的对照组。原始测序输出和过滤后的全长cDNA输出见表5，显示了相关的读段统计信息。
表5 所有样品原始解复用直接cDNA读段和全长cDNA读段的读段统计。
| 读段统计数据 | 原始解复用读段 | 全长cDNA读段 |
| 平均读段长度 | 1,055.4 | 514.2 |
| 平均读段质量 | 13.8 | 14.9 |
| 中位读段长度 | 688 | 354 |
| 中位读段质量 | 17.6 | 19.7 |
| 读段数量 | 5,482,094 | 1,047,472 |
| 读段长度N50 | 1,841 | 806 |
| 读段长度标准差 | 1,566.3 | 522.6 |
| 总碱基数 | 5,785,732,614 | 538,619,470 |
| 高于质量截断值的读段数量、百分比和兆碱基数 | ||
| >Q5 | 5,438,927 (99.2%) 5,739.9 Mb | 1,046,260 (99.9%) 538.3 Mb |
| >Q7 | 5,348,204 (97.6%) 5,672.5 Mb | 1,037,183 (99.0%) 535.6 Mb |
| >Q10 | 4,881,322 (89.0%) 5,231.2 Mb | 958,190 (91.5%) 492.5 Mb |
| >Q12 | 4,635,597 (84.6%) 5,051.0 Mb | 909,006 (86.8%) 470.4 Mb |
| >Q15 | 4,022,375 (73.4%) 4,525.0 Mb | 774,798 (74.0%) 401.4 Mb |
原始经解复用测序的总通量为5.74 Gb和548万条读段。N50读段长度显示，超过50%的读段长度大于1841 bp。平均Phred质量分数为13.8，对应碱基识别准确率为95.8%。中位读段质量为17.6，对应碱基识别准确率为98.3%。过滤后的全长cDNA读段总计538.3 Mb和105万条读段，N50读段长度大于806 bp。这些读段的平均Phred质量分数为14.9，对应碱基识别准确率为96.8%，而中位读段质量为19.7，对应碱基识别准确率为98.9%。将全长cDNA读段比对到参考基因组和转录组后发现，86%的读段能够成功比对。每个处理组全长cDNA读段比对到参考序列的深度和覆盖度表明，各参考序列间的基因表达不均匀。绝大多数转录本来源于蜡样芽孢杆菌。对分离的蜡样芽孢杆菌细胞进行的额外生长实验显示，其与图3中观察到的XO-LPO剂量依赖性抗菌效果相似，进一步证实了该细菌对该处理的敏感性。
主成分分析用于比较XO-LPO处理组和对照组之间的全局基因表达（图4A）。文库沿第一主成分分离，解释了52%的表达方差，表明XO-LPO处理显著影响了基因表达。RNA-seq共鉴定出4448个活跃表达的基因，其中198个基因表达显著差异，包括133个下调基因和65个上调基因（补充表S1）。火山图（图4B）展示了各组间所有基因的 -log10(校正后p值) 与log2倍数变化的关系。该图显示了显著下调和上调基因的整体分布，以及未被认为具有显著差异的基因。
为了解XO-LPO处理后基因功能变化的概况，使用eggNOG-mapper将差异表达基因与eggNOG 5数据库进行功能注释，为差异表达基因分配直系同源蛋白簇类别（图5）。具体而言，参与能量产生和转化的基因受处理影响很大，包括上调和下调的基因，表明细胞呼吸作用改变或能量依赖过程发生变化。与细胞周期控制、细胞分裂和染色体分配相关的基因减少，表明细胞生长减缓或出现导致细胞周期停滞的应激反应。此外，参与氨基酸、核苷酸、碳水化合物、辅酶和脂质代谢的基因发生显著变化，表明发生了全面的代谢重编程，这可能是对XO-LPO处理的适应性反应，细菌细胞重新分配资源以支持在新条件下的生存或生长。
基于整体RNA-seq数据，选择并突出了几个功能基因进行进一步分析，以更详细地解读XO-LPO处理对基因表达的影响。最相关的基因产物如图6所示，并在下文讨论。
显著下调的基因。 差异表达基因分析揭示了关键糖酵解酶的显著下调，包括丙酮酸激酶、醛缩酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶，以及糖酵解操纵子调节因子，表明糖酵解基因受到广泛抑制。含组氨酸磷酸载体蛋白丝氨酸激酶/磷酸酶的表达也下调。在革兰氏阳性菌中，这是控制中心代谢途径酶（如糖酵解酶）合成的信号转导途径中的初始酶。这些结果表明代谢发生了转变，可能从糖酵解转向替代代谢途径。与活性氧相关的主要抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和烷基过氧化氢还原酶，也显著下调。这表明细菌正在经历氧化应激，或者其管理氧化损伤的能力下降。分析还显示两个编码Dps蛋白的基因下调，Dps蛋白是在氧化应激期间由OxyR响应过氧化氢诱导的、唯一已知的直接参与基因组稳定性的蛋白质。此外，负责转录调控保护细胞免受活性氧损伤的蛋白质的基因，包括PerR和Fur调节因子，也被下调。活性氧相关基因表达降低表明解毒有害活性氧的能力下降，可能使细菌更容易受到氧化应激的影响。
显著上调的基因。 最显著的上调出现在与氨基酸和糖转运相关的基因中。ABC转运体底物结合蛋白是ABC转运体的亚基，在决定这些摄取系统的底物特异性方面起着关键作用。促进氨基酸转运的氨基酸通透酶表达增加，可能反映了氨基酸代谢的改变或营养摄取的增强。作为糖摄取磷酸转移酶系统一部分的磷酸转移酶上调，可能表明糖的运输和磷酸化增加。此外，观察到编码DoxX家族蛋白和罗丹素相关硫转移酶的基因上调。DoxX是一种膜蛋白，连接自由基解毒与胞质硫醇稳态；而硫转移酶催化氰化物和硫代硫酸盐之间的硫转移反应，将氰化物转化为毒性较低的硫氰酸盐。这些基因的上调表明增强了解毒有害化合物和维持细胞稳态的能力。赋予对主要由枯草芽孢杆菌产生的天然抗菌产物抗性的杆菌肽耐药十一异戊二烯焦磷酸酶也上调了。这种酶表达的增加表明悬浮液中其他细菌对来自枯草芽孢杆菌的抗生素压力产生了反应。与抗生素耐药性、营养摄取和解毒相关的上调基因表明，在XO-LPO处理条件下，细菌正在做出适应性反应以增加存活率，可能增强了营养获取和抵抗机制。
总体而言，差异表达基因的分析突显了细菌细胞对XO-LPO处理的复杂响应，影响了新陈代谢、应激反应和生存机制的各个方面。这些差异表达基因共同表明，细菌可能正在经历应激，并通过调节基因表达来增强在XO-LPO处理所施加的新条件下的生存能力。
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