耐温绿僵菌固态发酵产孢特性与生物防治潜力的系统评估
研究背景：固态发酵过程中的各种限制因素——如氧气扩散、热量积聚、物质传递问题以及工艺重复性的难题——严重阻碍了生物农药的生产，尤其是那些能用来防治昆虫的真菌。了解耐热真菌菌株的反应机制是克服这些限制的关键。不过，影响真菌生长和孢子形成的各种因素（温度、培养基和培养时间）可能会对真菌的杀虫活性产生影响，但这一点目前尚未被完全弄清楚。本研究以两株具有耐温特性的绿僵菌——M. brunneum EAMa 09/01-Su和M. robertsii EAMa 01/158-Su为对象，针对固体基质发酵（SSF）放大过程中氧气扩散受限、热量累积、传质困难及重复性差等瓶颈，系统探讨了温度、培养基成分和产孢时间对分生孢子产量、萌发特性及昆虫致病性的综合影响，旨在为耐温真菌菌株在生物农药规模化生产中的应用提供理论依据。
研究人员设计了恒定温度（CT）与变温（VT）两套实验体系，分别在15–33℃（M. brunneum）和15–40℃（M. robertsii）范围内，使用6种固体培养基（包括SDAY全营养、SDAY/4低营养、模拟稻壳RH、模拟啤酒糟BDr、模拟昆虫血淋巴的海藻糖培养基、模拟植物根际的棉子糖培养基）进行培养，并借助oCelloScope自动显微平台定量分生孢子产量与萌发动力学，同时以黄粉虫幼虫和成虫为靶标评估致病力。结果表明，生产条件显著影响终产品的"量"与"质"：M. brunneum在黄粉虫感染致死率和分生孢子萌发率方面表现更优，而M. robertsii则具有更快的萌发速度和更高的产孢量，且耐受更高温度。在变温策略下，M. robertsii经28℃生长4–7天后，即便在35–40℃高温下也能成功产孢；两种菌株在33–35℃产孢条件下所获分生孢子仍保持良好感染力。主成分分析进一步揭示，分生孢子产量与萌发时间呈关联，而黄粉虫致死率与最大萌发率密切相关，且萌发速率比产孢数量更能预测杀虫功效。该研究证实耐温绿僵菌菌株可有效应对SSF放大过程中的产热挑战，同时指出培养基成分与温度、时间的互作效应因菌株而异，意味着不同生产目标需匹配差异化的发酵参数优化方案，为后续中试放大提供了重要起点。
丹麦Biosense微生物生长动态监测系统的应用
将-80℃保存的孢子悬液用0.1% Triton-X稀释至10³–10⁵ spores mL⁻¹，每孔加样100 μL，在oCelloScope上利用"Fungal Spore Count"插件的"Metarhizium"专用模型进行图像采集与分析，每孔拍摄10张图像，通过算法识别并计数分生孢子，从而定量不同温度、培养基组合下的产孢量；随后基于计数结果将样品稀释至10³–10⁴ spores mL⁻¹，在同一设备上开展长达40小时的延时成像，每隔1.5小时采集一次图像。由于分生孢子萌发后算法所识别的"对象"数量会随时间递减，研究者巧妙地利用这一特征，以初始计数的最高孢子数为基准，通过计算各时间点剩余未萌发孢子比例，推导出最大萌发率、达到最大萌发率所需时间以及50%萌发时间等关键萌发动力学参数。
oCelloScope作为核心的自动化显微成像与定量分析平台，与Uni Explorer软件联用，承担了分生孢子产量计数与萌发动力学测定的双重职能，为评估模拟固体发酵条件下绿僵菌分生孢子的"量"与"质"提供了高通量、非侵入式的动态数据支撑。依托oCelloScope提供的这些高精度定量数据，研究团队得以揭示出"分生孢子产量与萌发时间相关联""黄粉虫致死率与最大萌发率密切相关"等核心发现，证明该设备不仅实现了对传统血球计数板人工计数方式的替代，更通过自动化、标准化的动态追踪，把分生孢子萌这一过去难以高通量量化的生物学过程，转化为了可统计、可比较的动力学指标，从而支撑了温度、培养基、产孢时间三因素与绿僵菌分生孢子产量、萌发及后续致病力之间复杂关系的系统解析
实验结论
通过模拟固体基质发酵条件系统评估了两株耐温绿僵菌的产孢特性与生物防治潜力，得出以下核心结论：两株菌株均具备应对发酵产热挑战的能力，但性状各有侧重——M. brunneum EAMa 09/01-Su在分生孢子萌发速率及对黄粉虫的致病力方面表现更优，而M. robertsii EAMa 01/158-Su则具有更快的萌发启动速度和更高的分生孢子产量，且耐受温度上限更高（可达40℃）。温度与培养基成分对孢子产量和质量的调控存在显著的互作效应：高温（33-35℃）虽会降低绝对产孢量，但能诱导产生萌发能力强、杀虫活性稳定的高质量分生孢子；培养基营养水平则显著影响产孢效率，中等营养水平的基质（如模拟啤酒糟BDr）在高温下更利于维持产孢与萌发的平衡。
变温策略（先适温生长后高温产孢）被证实可行，M. robertsii在28℃生长后即使经历35-40℃高温产孢，仍能获得具有侵染力的孢子，这为缓解固态发酵放大过程中的热累积难题提供了直接依据。此外主成分分析揭示出分生孢子的最大萌发率而非产量，与昆虫致死率呈正相关，表明萌发速率是评估真菌生物农药质量的更可靠指标。该研究证实利用耐温菌株结合优化的变温发酵工艺，可有效突破固态发酵放大的热力学限制，为高效、稳定的真菌生物农药规模化生产提供了重要的参数依据与菌株资源。
图1、在常温（CT）实验中获得的M. brunneum EAMa 09/01-Su菌丝体的产孢量及存活情况。a) 各培养基条件下温度对菌丝体产孢的影响；b) 和 c) 不同培养基及不同温度下的50%萌发时间；d) 和 e) 不同培养基及不同温度下的最大萌发速率。条形图表示均值±标准误。不同小写字母表示各子项目内不同实验条件间具有显著差异。
图2、在变温（VT）实验中获得的M. brunneum EAMa 09/01-Su的分生孢子产生量及存活率。恒温条件下，a)、c) 和 e) 图中显示了培养基与温度的相互作用，以培养基为面；b) 图中显示了培养基、温度和时间的相互作用，以培养基为面；d) 图中显示了培养基与时间的关系；f) 图中显示了培养基、温度与时间的交互作用。a) 和 b) 图展示分生孢子产生量；c) 和 d) 图显示50%萌发时间；e) 和 f) 图显示最大萌发时间。条形图表示均值±标准误差
图3、在CT实验中获得的M. robertsii EAMa 01/158-Su分生孢子的产生量和萌发率。图a）显示温度与培养基相互作用对分生孢子产生的影响，b）显示温度与培养基相互作用对最大萌发率的影响，其中温度为变量因子。条形图表示均值±标准误差。不同小写字母表示各温度组内不同实验条件间具有显著差异。
图4、在VT实验中获得的M. robertsii（EAMa 01/158-Su）的分生孢子产量。恒温条件下，a) 以培养基为面、温度为变量的交互作用；b) 以培养基为面、温度×时间为变量的交互作用；c) 以温度×时间为面的交互作用。条形图表示均值±标准误差。不同小写字母表示各组条件之间的显著差异。
图5、在T. molitor幼虫（a-b）和成虫（c-d）的CT与VT温度实验中，M. brunneum EAMa 09/01-Su的比较致病性。CT实验结果显示在图a和c中，而BDr培养基上的VT实验结果显示在图b和d中。虚线黑线表示中位致死时间。
总结
研究通过模拟固体基质发酵条件系统评估了两株耐温绿僵菌的产孢特性与生物防治潜力，得出以下核心结论：两株菌株均具备应对发酵产热挑战的能力，但性状各有侧重——M. brunneum EAMa 09/01-Su在分生孢子萌发速率及对黄粉虫的致病力方面表现更优，而M. robertsii EAMa 01/158-Su则具有更快的萌发启动速度和更高的分生孢子产量，且耐受温度上限更高（可达40℃）。
温度与培养基成分对孢子产量和质量的调控存在显著的互作效应：高温（33-35℃）虽会降低绝对产孢量，但能诱导产生萌发能力强、杀虫活性稳定的高质量分生孢子；培养基营养水平则显著影响产孢效率，中等营养水平的基质（如模拟啤酒糟BDr）在高温下更利于维持产孢与萌发的平衡。变温策略（先适温生长后高温产孢）被证实可行，M. robertsii在28℃生长后即使经历35-40℃高温产孢，仍能获得具有侵染力的孢子，这为缓解固态发酵放大过程中的热累积难题提供了直接依据。
此外，主成分分析揭示出分生孢子的最大萌发率而非产量，与昆虫致死率呈正相关，表明萌发速率是评估真菌生物农药质量的更可靠指标。该研究证实利用耐温菌株结合优化的变温发酵工艺，可有效突破固态发酵放大的热力学限制，为高效、稳定的真菌生物农药规模化生产提供了重要的参数依据与菌株资源。
oCelloScope作为核心的自动化显微成像与定量分析平台在本研究中承担了分生孢子产量计数与萌发动力学测定的双重职能，为评估模拟固体发酵条件下绿僵菌分生孢子的"量"与"质"提供了高通量、非侵入式的动态数据支撑。依托oCelloScope提供的这些高精度定量数据，研究团队得以揭示出"分生孢子产量与萌发时间相关联""黄粉虫致死率与最大萌发率密切相关"等核心发现，证明该设备不仅实现了对传统血球计数板人工计数方式的替代，更通过自动化、标准化的动态追踪，把分生孢子萌这一过去难以高通量量化的生物学过程，转化为了可统计、可比较的动力学指标，从而支撑了温度、培养基、产孢时间三因素与绿僵菌分生孢子产量、萌发及后续致病力之间复杂关系的系统解析。
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