宽口裂腹鱼中肾组织细胞系的建立及最适培养条件筛选
1.2.5 最适血清浓度筛选
在已确定最适培养基与最适温度的基础上，保持其他条件一致，设置 0%、5%、10% 和 20% 四个 FBS 浓度梯度，其中 0% 为对照组。将等量的中肾细胞接种于 96 孔培养板，每孔 200 μL，每组设 3 个复孔，置于 25 ℃、5% CO₂培养箱中，由 oCelloScope 连续监测。于培养 0、24、48、72 和 96 h 读取细胞浓度，绘制不同血清浓度下的生长曲线。
1.2.6 生长曲线测定与群体倍增时间计算
取第 10 代中肾细胞溶液接种于 96 孔培养板，在最适条件(DME/F-12 培养基、25 ℃、20% FBS)下培养。分为 8 组，每组设 3 个复孔，置于 25 ℃、5% CO₂培养箱中。采用 oCelloScope 连续 7 d 自动扫描计数，每日读取 1 次细胞浓度，同时同步记录细胞面积、圆度等形态学参数。以培养天数(t)为横坐标，以每日计数的平均数(细胞密度×10⁴)为纵坐标绘制生长曲线。细胞群体倍增时间按下式计算：
T = t \cdot \lg 2 / \lg (N_t / N_0)
式中，T 为群体倍增时间，t 为培养时间，Nt 为 t 时刻的细胞数，N₀ 为接种时的起始细胞数。
1.2.7 细胞冻存与复苏
冻存液配方为 10% DMSO、20% FBS 和 70% DME/F-12。冻存液配置后预冷，以减小细胞接触冻存液时的温度冲击。调整细胞浓度至 2×10⁶ 个/mL，分装于冻存管，置于液氮中保存。复苏时按细胞∶培养液=1∶5 的比例进行复苏培养，以快速稀释常温下具细胞毒性的 DMSO。
复苏后细胞增殖曲线的测定由 oCelloScope 完成，替代常规 MTT 比色法。将复苏细胞接种于 96 孔培养板，置于 25 ℃、5% CO₂培养箱内，于 0、24、48 和 72 h 由系统自动扫描，经 BCA 算法生成复苏后生长动力学曲线。采用该方法的优势在于：无需加入 MTT 等底物或终止液，不破坏细胞，可对同一批细胞进行全程连续观测，避免了终点法需在每个时间点另设复孔所带来的人力与孔位消耗。复苏存活率测定采用台盼蓝染色法。复苏后经台盼蓝染色，采用 oCelloScope 成像并基于图像分割算法分别计数着色(死)细胞与未着色(活)细胞，计算存活率，重复 10 组取平均值。
1.2.8 细胞形态学成像
原代培养过程及复苏后培养过程中的细胞形态观察，采用 oCelloScope 的无标记明场活细胞成像模式完成。将待观察的细胞悬液转入 96 孔平底培养板，由系统自动对焦、自动校准光源并采集图像，经 UniExplorer 软件输出明场图像与延时序列。该方法无需固定、无需染色，可在不干扰细胞生长的前提下获得连续的时间序列图像，用于记录组织块迁出、细胞增殖及复苏后生长状态。
1.2.9 细胞污染检测
采用通用引物，通过 PCR 技术对培养细胞进行细菌、真菌及支原体污染检测，以排除微生物污染对后续实验结果的干扰。
1.2.10 细胞来源鉴定
使用基因组 DNA 提取试剂盒提取中肾组织细胞 DNA。选用进化缓慢的保守序列 16S rRNA，根据宽口裂腹鱼 16S rRNA 序列设计特异性引物(表 1)。PCR 扩增采用 50 μL 反应体系：25 μL 2×Taq PCR MasterMix，上、下游引物各 2.5 μL，5 μL 模板 DNA，15 μL 灭菌超纯水。反应条件为：95 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，48.9 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，共 35 个循环。扩增结束后取 8 μL PCR 产物，于 1% 琼脂糖凝胶中电泳检测。PCR 产物送测序，与 GenBank 中已发表序列进行 Blast 比对，获得序列一致率。
表 1 引物序列（Tab.1 Primer sequence）
2 结果
2.1 原代培养与传代
采用 oCelloScope 无标记明场成像逐日观察。培养至第 4 天，宽口裂腹鱼中肾组织块周围开始有细胞迁出，细胞由组织块向周围溢出，形态呈不规则团状连接结构(图 2a)。第 9 天，约 70% 的细胞瓶底面被细胞铺满(图 2b)。自第 4 天开始迁出至第 9 天覆盖七成瓶底，表明迁出细胞的增殖速度较快。第 15 天，细胞呈悬浮生长(图 2c)，按 1∶2 进行传代培养。传代后逐日观察，细胞生长速度较快。
图 2 宽口裂腹鱼中肾组织细胞原代培养（标尺 100 μm，oCelloScope 无标记明场成像）
2.2 最适培养基
在 M199、L-15、MEM、RPMI-1640 和 DME/F-12 五种培养基中同条件培养 4 d，经 oCelloScope 连续测定，各时间点相对细胞数量排序为：DME/F-12 > L-15 > RPMI-1640 > M199 > MEM(图 3)。其中 DME/F-12 增势最大。培养 3 d 后，除 DME/F-12 外，其余 4 种培养基的增长速度均趋于平缓。在次优选项中，L-15 效果优于其他 3 种，差异在 2 d 后较为明显。M199 与 RPMI-1640 效果较为接近，RPMI-1640 略高。MEM 表现最弱。综合比较，宽口裂腹鱼中肾组织细胞的最适培养基为 DME/F-12。
图 3 细胞培养的最适培养基
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