丹麦某养猪场曲霉菌分离株培养鉴定、多重耐药性分析
2.2 真菌从采样材料中提取
返回实验室后，从GSP中取出聚碳酸酯滤膜，通过在5.0mL提取液（0.85%NaCl和0.05%Tween80）中以500rpm摇动10分钟，从滤膜中提取嵌入的空气传播颗粒。对于稻草颗粒的提取，向含有收集稻草的15mL管中加入7.0mL提取液，然后水平摇动15分钟。沉积粉尘和粪便样本通过将拭子垂直剧烈涡旋5分钟从eSwabs中提取。提取后，所有样本（空气粉尘、沉积粉尘、稻草和粪便物质）分别储存和处理。对于所有样本类型，将1mL提取样本和500μL 87%甘油涡旋混合，然后储存在-80摄氏度直至进一步处理。
2.3 培养和鉴定
对于真菌菌落形成单位（CFUs）的鉴定，将200μL解冻样本一式两份接种在补充氯霉素的二氯硝基苯甘油琼脂（DG18）上，并在37摄氏度下孵育。通过取少量真菌材料从平板上分离单个真菌菌落，然后在DG18上进行亚培养。将少量亚培养的真菌材料从DG18培养基转移到沙氏葡萄糖肉汤中，在室温下过夜孵育以获得菌丝生长（孢子很少或没有）。然后使用微flex Biotyper系统（Bruker Daltonics）上的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行鉴定，使用乙醇提取方案。使用Biotyper 3.1软件和BDAL库将真菌分离株鉴定到种水平（定义为评分>2.0）。使用细菌测试标准（BTS）（Bruker）校准系统。随后将分离株冷冻在-80摄氏度直至进一步处理。仅使用曲霉属的分离株进行抗真菌耐药性测试，因为非念珠菌属和非曲霉属真菌缺乏折点或临界值。
2.4 抗真菌耐药性测试
从不同采样材料（空气粉尘、沉积粉尘、粪便和稻草）中分离的所有曲霉属菌落（n=43）被选中进行抗真菌耐药性测试，针对三类抗真菌药物：三唑类（伊曲康唑和伏立康唑；Sigma-Aldrich，德国维也纳）、棘白菌素类（卡泊芬净醋酸盐；Sigma-Aldrich）和多烯类（两性霉素B）。
伊曲康唑的测试浓度范围为15.6μg/L至8.0mg/L。伏立康唑、卡泊芬净和两性霉素B的测试浓度范围为31.25μg/L至16.0mg/L。所有抗真菌药物均溶解于DMSO中，并在-80摄氏度下冷冻保存直至使用。
我们使用EUCAST肉汤微量稀释法（产孢子霉菌版本EDef 9.3.2）来确定上述抗真菌药物的最低抑菌浓度（MICs）和最低有效浓度（MECs）。MIC被认为完全抑制菌株生长的最低浓度，MEC被认为是导致异常菌丝生长的最低药物浓度。通过目视在48小时读取MIC，通过显微镜读取MEC。
简而言之，将分离的真菌在37摄氏度的沙氏葡萄糖琼脂上培养2-5天，直至产生足够的孢子。通过将无菌棉签浸入0.1%（v/v）Tween 20水溶液中，然后在孢子上摩擦，从培养基上收获孢子。通过将棉签头部与5mL 0.1%Tween 20混合并剧烈摇动来提取孢子。在制备接种物稀释系列之前，将孢子提取物涡旋20秒。使用血细胞计数板（Reichert，德国慕尼黑）计数孢子数量后，将孢子浓度调整至2.0至5.0×10^5孢子/mL之间。用100μL孢子悬浮液接种含有100μL双倍浓度RPMI-1640（ThermoFisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的微孔板，其中含有2%葡萄糖和MOPS缓冲液（Sigma Aldrich，德国），pH为7.0，含有稀释系列的抗真菌药物。微孔板的最后两列分别用作生长阳性对照和试剂无菌阴性对照。这些列不含抗真菌药物。对于阴性对照，使用与制备最终稀释液相同的储液瓶中的100μL无菌水。接种的微孔板在37摄氏度下孵育2天，然后读取MIC和MEC。
对于烟曲霉、土曲霉和构巢曲霉，根据EUCAST抗真菌临床折点表版本10.0定义分离株为抗真菌耐药（R）或敏感（S）。对于黑曲霉和杂色曲霉，没有官方的R或S命名，但这些物种的MIC已被注意到比烟曲霉的流行病学临界值（ECOFF）高一个两倍稀释度。对于其他物种（白曲霉和灰绿曲霉），目前尚无折点。此外，棘白菌素类对曲霉属没有可用的折点。
一旦读取了分离株的MIC和MEC，使用Epoch微孔板分光光度计（BioTek，美国佛蒙特州威努斯基）测量600nm处的光密度（OD600），使用上述阴性对照作为空白。每个抗真菌药物在每个稀释度下的OD600平均值（n=2）用于定量48小时后形成的生物量。
2.5 扩展耐药性测试
对一株具有疑似矛盾耐药性的黑曲霉进行扩展耐药性测试，使用oCelloScope系统（BioSense Solutions ApS，丹麦）。使用上述EUCAST方法进行抗真菌耐药性测试，伊曲康唑浓度梯度范围为64mg/L至15.6μg/L，一式四份。oCelloScope的相机焦距设置为2790μm，照明水平为300，图像采集在每个孔中心的一个扫描区域进行，每30分钟扫描一次，持续48小时。菌株的生长动力学通过基于对比度的分割提取表面积（SESA）算法进行图像堆栈处理确定，该算法包含在UniExplorer软件中。
2.6 数据可视化
所有数据可视化均在R版本4.0.0中使用Rstudio版本1.3.959和R CRAN包ggplot2进行。
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