PIM0、PIM1、PIM2对肠炎及肯塔基沙门氏菌的MIC与生长抑制性能、安全性评价
1.4 PIM的抑菌性能评价
1.4.1 最小抑菌浓度测定
分别挑取肠炎沙门氏菌C50041和TX14、肯塔基沙门氏菌TK2和HJ8菌株单克隆接种于4 mL LB液体培养基中静置培养12~14 h。在96孔板中加入100 μL的MH培养基，调整上述菌液至OD600 nm=1.0后稀释1000倍，取100 μL加入96孔板的第1列并依次倍比稀释，同时设立阳性对照（不含PIM的细菌对照孔）和阴性对照（仅含培养基的对照孔），以大肠杆菌25922作为质控菌株。将96孔板放入37 ℃恒温培养箱中培养16~18 h，酶标仪测定，计算细菌的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）值。
1.4.2 生长曲线测定
根据测定的MIC值，使用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统oCelloScope测定4种试验菌株在不同PIM浓度处理时的生长曲线：分别挑取肠炎沙门氏菌C50041和TX14、肯塔基沙门氏菌TK2和HJ8菌株单克隆接种4 mL的LB液体培养基中，于37 ℃、180 r/min培养箱中培养12 h，调整细菌浓度至107 CFU/100 μL；用 LB培养基将不同 PIM分别稀释至10、30、50和100 μg/mL加入96孔板中（100 μL/孔），再加入稀释好的菌液（100 μL/孔），置于微生物生长动态监测系统oCelloScope中连续监测24 h内细菌的生长情况，绘制生长曲线分析PIM对沙门氏菌生长的影响。
1.4.3 菌落形成单位涂板计数
分别挑取肠炎沙门氏菌C50041和TX14、肯塔基沙门氏菌TK2和HJ8菌株单克隆接种至4 mL LB液体培养基中，37 ℃ 180 r/min培养箱中培养12 h，调整细菌浓度至107 CFU/mL；分别取200 μL稀释好的菌悬液与200 μL稀释好的PIM混合均匀，37 ℃恒温培养箱中静置培养0.5 h，用无菌PBS进行10倍梯度稀释后取10 μL涂布LB平板；于37 ℃恒温培养箱中静置培养12~14 h，使用丹麦BioSense公司µCount3D微生物计数仪自动统计单菌落数量。按照以下公式计算细菌的存活率：δ=（Asurvival / Acontrol）×100%，其中 δ 为细菌存活率（%），Asurvival 为处理组内存活的微生物菌落总数，Acontrol 为对照组内存活的微生物菌落总数。
1.5 PIM的安全性评价
1.5.1 体外细胞毒性检测
采用 CCK8试验法评估 3种 PIM对鸡巨噬细胞HD11和人HeLa细胞的体外细胞毒性：分别将生长状态良好的HeLa细胞和HD11细胞调整至2×10⁴个/mL，置于96孔细胞培养板中（100 μL/孔）继续培养 24 h，每孔分别加入 100 μL不同浓度（30、50、100、1000 μg/mL）的抑菌材料PIM0、PIM1和PIM2，同时设立阳性对照（加入700 mg/L的NaClO溶液）和阴性对照孔，置于细胞培养箱内继续培养 24 h；弃去培养液，每孔分别加入 100 μL的10% CCK-8 Solution，培养箱孵育2 h，用酶标仪测定OD450 nm时的吸光度。按照以下公式计算细胞的存活率：V（%）=［（试验组吸光值-空白组吸光值）/（对照组吸光值-空白组吸光值）］×100%。
1.5.2 体内安全性评估
取6~8周龄的雌性BALB/c小鼠，随机分成7组，每组6只，分别灌胃PBS以及100 μg/mL、1000 μg/mL的 PIM0、PIM1、PIM2，200 μL/只；观察记录小鼠的行为异常变化、体重、存活情况等。选择PBS和 PIM2处理组小鼠，分别在0、3、7、14、21 d扑杀小鼠并收集肝脏和盲肠，用 10%甲醛溶液固定24 h后置于脱水机中用梯度乙醇脱水、透明（二甲苯）以及浸蜡（63 ℃蜡缸），制备组织切片；将切片依次放入二甲苯I 20 min、二甲苯II 20 min、无水乙醇I 5 min、无水乙醇II 5 min、75%酒精5 min，自来水洗；浸入苏木素染液（3~5 min），自来水洗，酸性分化液分化，自来水洗；使用返蓝液将切片返蓝，流水冲洗；依次用85%、95%的梯度酒精脱水各5 min，放入伊红染液中染色5 min；再依次放入无水乙醇I 5 min、无水乙醇II 5 min、无水乙醇III 5 min、二甲苯 I 5 min、二甲苯 II 5 min直至透明，最后用中性树胶封片。采用普通光学显微镜观察组织切片，采集组织病理学图像，评估组织结构完整性、细胞形态变化、炎症浸润及病理损伤特征等。
1.6 PIM对实验室沙门氏菌模拟污染的抑菌效果分析
使用瓷砖和不锈钢钢板分别模拟家禽屠宰等生产过程中的地面和设备表面，将肠炎沙门氏菌C50041和肯塔基沙门氏菌TK2菌悬液（2×10⁷ CFU/mL）分别均匀喷洒在瓷砖和不锈钢表面，再分别均匀喷洒不同浓度（10、30、50和100 μg/mL）的抑菌材料 PIM0、PIM1和 PIM2，室温静置30 min；用无菌棉签擦拭瓷砖和不锈钢板表面，置于1 mL无菌PBS中充分震荡后依次10倍稀释，分别量取100 μL稀释液涂布LB平板培养，使用丹麦BioSense公司µCount3D微生物计数仪自动统计单菌落数。按照以下公式计算抑菌率：抑菌率IR（%）=（试验组单菌落数/空白组单菌落数）×100%。
1.7 统计与分析
所有试验均进行3次以上独立重复，使用GraphPad Prism 8软件对CFU涂板计数、CCK8和抑制率等结果进行处理，并绘制成柱状图。试验数据采用“平均值±标准差”表示，使用t检验对数据进行统计学分析，P<0.05时表示具有统计学显著差异。
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