不同浓度PIM处理下肠炎沙门氏菌生长曲线的动态变化
2 结果与分析
2.1 PIM的化学合成结果
3种PIM的分子结构式和核磁共振氢谱图见图2。根据化学位移值的大小，将3种PIM中的各个氢原子进行归属，分别为：PIM0：¹H NMR（300 MHz，D₂O，δ）：8.91（s，1H，CH=N−），7.54（s，2H，=CH），4.27（s，4H，N−CH₂），2.25（s，2H，CH₂）；PIM1：¹H NMR（300 MHz，D₂O，δ）：8.74（s，1H，CH=N−），7.43（s，2H，=CH），4.15（s，4H，N−CH₂），1.82（s，4H，CH₂）；PIM2：¹H NMR（300 MHz，D₂O，δ）：8.68（s，1H，CH=N−），7.39（s，2H，=CH），4.07（s，4H，N−CH₂），1.77（s，4H，CH₂），1.21（s，11H，CH₂）。从氢原子化学位移值的大小及其归属情况可知，3种PIM的分子结构与目标化学物结构是一致的。
2.2 不同PIM对沙门氏菌MIC的测定
结果显示，3种PIM对沙门氏菌的MIC值均不高于36 μg/mL，且低于质控对照菌株大肠杆菌25922的MIC值。参考《NY/T 3384-2021畜禽屠宰企业消毒规范》待屠区推荐消毒剂种类及使用浓度是有效氯含量 700~1000 μg/mL 的含氯消毒剂，表明3种PIM对4种细菌均有较好的抑菌效果（见表1）。此外，不同PIM材料的抑菌能力表现出PIM2、PIM1、PIM0依次下降的趋势；不同血清型沙门氏菌对PIM材料的耐受程度也有差异。
| 细菌名称 | PIM0/(μg/mL) | PIM1/(μg/mL) | PIM2/(μg/mL) |
|---|---|---|---|
| 肠炎沙门氏菌C50041 | 32 | 16 | 8 |
| 肠炎沙门氏菌TX14 | 36 | 8 | 4 |
| 肯塔基沙门氏菌TK2 | 36 | 4 | 4 |
| 肯塔基沙门氏菌HJ8 | 32 | 8 | 2 |
| 大肠杆菌25922 | 64 | 32 | 16 |
2.3 不同PIM对沙门氏菌生长曲线的测定结果
结果显示，未经PIM处理的菌株在0~8 h内呈现指数型增长进入生长期，8 h后细菌数量增长速度减缓进入稳定期；相较之下，经过PIM1和PIM2处理的菌株在细菌数量达到峰值后，开始出现不同程度的下降。在PIM0处理后，4种菌株仍能正常生长且在高浓度条件下也未表现出显著差异，表明PIM0的抑菌效果较弱。肠炎沙门氏菌在PIM1处理8 h后，不同浓度下的细菌数量开始不同程度下降，特别是在12 h、50 μg/mL时已显著抑制细菌生长（P<0.001或P<0.05），而在24 h、10 μg/mL时同样出现显著差异（P<0.001或P<0.05）。相比之下，PIM2处理后在4 h、50 μg/mL就显著抑制细菌生长，且随着浓度的增加，抑菌效果进一步增强，表明PIM2的抑菌效果更强。对于两株肯塔基沙门氏菌，在PIM1浓度高于50 μg/mL时，4 h后即出现抑制作用，并在12 h后表现出显著的抑菌效果（P<0.001或P<0.05）；而PIM2在低浓度（10 μg/mL）下，4 h后便显现出较为显著的抑菌效果（P<0.001或P<0.05），100 μg/mL浓度时完全抑制了细菌生长。由此可见，PIM2的抑菌效果最好，PIM1其次，PIM0效果最差，这与MIC值检测结果一致。此外，不同血清型菌株对PIM的敏感性表现出差异性。
（图不同PIM对肯塔基沙门氏菌TK2和HJ8生长的影响）
2.4 基于细菌计数法的不同PIM对沙门氏菌生长的影响
PIM1与4个菌株共孵育后，仍有细菌生长；而PIM2在10 μg/mL的低浓度下仅有极少细菌存活，其他更高浓度下几乎无细菌生长，说明PIM2对4个菌株的抑菌效果显著强于PIM1，与MIC值和生长曲线测定结果一致。根据《NY/T 3384-2021畜禽屠宰企业消毒规范》规定，市售常用消毒剂NaClO在高浓度（700 mg/L）时才无细菌生长，说明PIM的抑菌能力显著高于常用消毒剂NaClO。
2.5 PIM的细胞毒性体外评价结果
PIM对不同细胞的毒性CCK8检测结果显示，在30、50和100 μg/mL浓度处理下，HD11和HeLa细胞在3种PIM中的存活率均很高（80%以上），在很高浓度PIM（1000 μg/mL）处理后细胞存活率才有较明显的下降（50%左右），但是仍然显著高于推荐浓度NaClO溶液（700 mg/L）处理后的存活率（P<0.001），说明3种PIM的体外细胞毒性均较小。经相同浓度的PIM0、PIM1和PIM2处理后，细胞存活率依次降低，说明PIM2的体外细胞毒性相对更大。此外，同种PIM随着浓度的增加，其细胞存活率也逐步下降，说明PIM的细胞毒性呈剂量依赖性。
2.6 PIM对小鼠的体内安全性评价结果
结果显示，21 d的试验周期内，各组小鼠均无死亡，且活动正常、采食与饮水正常，未见急性中毒症状或明显的行为异常等（见表2）；不同PIM处理组小鼠体重在14 d内与PBS组相比无显著差异（P>0.05），且呈现轻微增长趋势，21 d时体重已显著高于PBS组（P<0.05），表明PIM处理未对小鼠的生长造成明显影响。
| 项目 | 浓度/(μg/mL) | 每组小鼠数量/只 | 每组小鼠死亡数量/只 | 存活率/% |
|---|---|---|---|---|
| PIM0 | 100 | 6 | 0 | 100.0 |
| PIM0 | 1000 | 6 | 0 | 100.0 |
| PIM1 | 100 | 6 | 0 | 100.0 |
| PIM1 | 1000 | 6 | 0 | 100.0 |
| PIM2 | 100 | 6 | 0 | 100.0 |
| PIM2 | 1000 | 6 | 0 | 100.0 |
| PBS | — | 6 | 0 | 100.0 |
选择毒性相对更大的PIM2采用组织切片HE染色分析其对小鼠肝脏和盲肠可能造成的病理影响。结果显示，100 μg/mL的PIM2导致肝脏轻微的炎症反应，未见明显坏死和纤维化，盲肠黏膜层轻微糜烂和肠腺脱落。相比之下，1000 μg/mL的PIM2诱导肝脏相对更严重的水样变性、静脉淤血和脂肪变性，盲肠更严重的黏膜损伤和炎性细胞浸润，肠道屏障稳定性受损。虽然高浓度处理后观察到肝细胞变性及盲肠损伤，但整体损伤程度较低，且在21 d时损伤范围有所缩小，炎症反应减轻，呈现随时间的可逆修复。
2.7 PIM对模拟污染沙门氏菌的抑菌效果
3种PIM对模拟污染沙门氏菌的抑菌效果，瓷砖表面的肠炎沙门氏菌C50041与不锈钢板表面的肯塔基沙门氏菌TK2在低浓度PIM2（10 μg/mL）作用下，抑菌率达到99.8%以上，当浓度升高到30 μg/mL以上时，抑菌率为100%；PIM0各种浓度的抑菌率均在50%以下；PIM1各种浓度的抑菌率在50%~90%之间。说明PIM2对模拟污染的沙门氏菌杀菌效果最好，PIM1和PIM0逐渐减弱。
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