大肠杆菌噬菌体Φ199一步生长曲线、与盐酸克林霉素体外联合应用效果（一）
摘要：旨在探究大肠杆菌噬菌体Φ199与盐酸克林霉素体外联合应用的效果。对以大肠杆菌O157:H7为宿主菌的噬菌体Φ199的生物学特性进行了研究，并对噬菌体Φ199与盐酸克林霉素联用抗菌效果进行评估。结果：噬菌体Φ199是肌尾噬菌体，其头部直径约为50 nm，尾部长度约为100 nm；噬菌体Φ199能够在40~60℃稳定存活，并且在pH值3~12范围内保持活性，表明噬菌体Φ199具有较宽的温度、酸碱耐受性；噬菌体Φ199的最佳感染复数(MOI)为1，一步生长曲线显示潜伏期为5 min，裂解期为5 min，裂解量为44，能够在3 h内抑制细菌生长；抗生素联合应用结果显示，噬菌体Φ199与盐酸克林霉素联合应用有协同作用，与效价为10^6~10^7 PFU/mL的噬菌体联用时可将抗生素有效浓度降低至1/2 MIC，在与效价为10^8 PFU/mL的噬菌体联用时可将抗生素有效浓度降低至1/4 MIC。
大肠杆菌O157:H7是一种重要的食源性致病菌，常通过消化道进入动物体内，定殖并破坏肠黏膜上皮细胞，通过产生志贺毒素引起细胞死亡并进入血液循环，对机体造成损伤。大肠杆菌O157:H7主要传染源是感染者和无症状携带者，通常能够通过受污染的食物和水感染人，引起腹泻、发热、呕吐等症状，具有较高的发病率和死亡率，是一种重要的人兽共患病原菌。抗生素是治疗大肠杆菌O157:H7感染的主要手段，但是部分研究人员从环境和人体粪便样本中分离到该菌耐药菌株，这些耐药菌株可能限制了抗生素治疗的疗效。自20世纪80年代，人们就发现对青霉素等抗生素具有耐药性的大肠杆菌O157:H7菌株。近年来，随着抗生素的普及，多重耐药菌也逐渐增多，如今，人们能够从奶牛等动物体内检测出具有耐氨苄西林、头孢菌素、卡那霉素等多种抗生素的多重耐药大肠杆菌O157:H7菌株，这为该菌感染的进一步防治带来了挑战。
噬菌体是一种在自然界中广泛存在的微生物，作为细菌的天然克星，其具有动态自适应靶向能力、高度的物种特异性、良好的生物相容性以及能够裂解耐药细菌等优势。近年来，噬菌体治疗的相关研究取得了一定进展。一项研究表明，用噬菌体处理多重耐药肺炎克雷伯菌感染的伤口时表现出高达99%的愈合效率。此外，研究人员通过将3种针对O157:H7大肠杆菌的噬菌体混合成"鸡尾酒"治疗小鼠肠炎，显著提高了小鼠存活率以及预后效果。这些试验都证明了噬菌体治疗的可能性。然而，噬菌体和细菌始终处于竞争关系中，细菌可能在短时间内通过修饰受体或其他突变机制逃避噬菌体的感染，获得对噬菌体的抗性，导致单一的噬菌体无法彻底清除细菌感染。
基于抗生素和噬菌体对细菌不同的杀菌机制，临床或试验中尝试将抗生素和噬菌体联合治疗，与单纯抗生素或噬菌体治疗相比，可避免细菌对单纯抗生素或单纯噬菌体产生耐药性，显著提高患者的治愈比例，且通过正确的联合用药还能够降低药物的副作用，提高治疗效果。本试验检测了大肠杆菌噬菌体Φ199最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线等生物学特性，同时也检测了大肠杆菌O157:H7对不同抗生素的耐药性，在此基础上探究了噬菌体与盐酸克林霉素联合用药的效果。
1材料与方法
1.1材料
大肠杆菌O157:H7菌株为江苏省疾病预防与控制中心惠赠，南京农业大学动物医学院人兽共患病实验室保存；噬菌体为实验室分离保存的肌尾科噬菌体Φ199；Mueller-Hinton(MH)培养基购自海博生物技术有限公司；盐酸克林霉素购自北京索莱宝科技有限公司。
1.2噬菌体效价测定
采用双层平板法进行噬菌体增殖。宿主菌O157:H7大肠杆菌培养至对数期，取100μL菌液与100μL噬菌体混合均匀，加入45℃的Luria-Bertani(LB)半固体中，混匀后倒入LB平板。30℃过夜培养，待平板上长满空斑后取出平板，加入5 mL SM液，4℃放置12 h。最后吸取SM液用0.22μm的滤膜过滤，所得滤液即为噬菌体裂解液，于4℃保存备用。
采用双层平板法进行噬菌体效价测定。上述噬菌体裂解液用SM液进行10倍倍比稀释，每个稀释度取100μL与100μL对数期大肠杆菌O157:H7混匀，加入45℃的LB半固体中，混匀后倒入LB平板。30℃过夜培养，第2天取出平板，计数噬菌斑为30~300之间的平板。重复以上操作3次，取平均数为对应噬菌体的效价。
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