培养物中的颗粒大小

为测定时间-杀灭实验中丝状化的程度，使用流式细胞术研究细菌颗粒大小随时间的变化。使用带有GFP基因标记的LM347类似菌株，可通过流式细胞术测量。该菌株此前已由Gullberg等构建并研究，我们使用了相同的类似菌株。过夜培养物在2mL MHII肉汤中生长。第二天，按照与时间-杀灭实验相同的程序，将20μL培养物转移至2mL新鲜预热的MHII肉汤中。向每管加入环丙沙星，终浓度为0×、0.5×和1×MIC。在加入抗生素后1、2、4、6、9和24小时取样。从无抗生素管中，每个时间点取5μL培养物，用500μL无菌过滤的0.9%NaCl稀释。从含环丙沙星的管中，每个时间点取5μL至1mL样本。为获得约10⁶cfu/mL的适当浓度，细胞或用0.9%NaCl稀释，或通过5000rpm离心6分钟浓缩并重悬于0.9%NaCl中。每个样本分析10⁵个细胞。去除上清后，加入足量PBS重悬细胞沉淀。样本涡旋5秒后，用流式细胞仪（BD FACS Aria细胞分选仪）分析。荧光（蓝色488nm激光）由FITC滤光片检测（502nm长通滤光片，530/30nm带通）。我们首先基于侧向散射光高度（SSC-H）排除噪声和碎片，仅分析具有黄色荧光的细胞。荧光细胞与非荧光细胞及碎片之间有清晰分离。我们仅门控荧光细胞。每个样本至少记录100000个事件。

oCelloScope实验

使用oCelloScopeTM监测0.5×MIC浓度下细胞形态随时间的变化。细菌接种物如上所述在预热的MHII肉汤中制备，但第二次稀释按1:50进行，以在微孔板（带盖96孔微孔板；Thermo Scientific Nunc，货号10378937）中进一步1:2稀释，微孔板中已含有100μL含不同浓度环丙沙星的MHII。通过放大最佳聚焦区域并导出，选择丝状化的代表性图像。

计算机建模

基于机制的PK/PD模型

以此前为化脓性链球菌开发的一般基于机制的PK/PD模型作为模型开发的起点。在开发环丙沙星-大肠杆菌模型期间，测试了不同的结构模型，包括具有不同药物易感性的预先存在亚群的表征、非菌落形成细菌亚群以及适应性耐药机制。搜索了适用于所有七个菌株的共同结构的简约模型。已报道环丙沙星在培养基中稳定，且在预实验中被证明在37°C下24小时内稳定；因此，假设在24小时时间-杀灭实验期间浓度恒定。系统中部分细菌转移至非菌落形成状态的时间通过MTIME函数估计。

数据分析

典型模型参数和残差误差基于所有数据在NONMEM 7中同时估计；因此，所有菌株使用相同模型拟合。使用Laplacian估计方法和ADVAN13。在选择嵌套模型时，使用目标函数值（OFV）的差异。在NONMEM中，OFV是似然对数的-2倍。当OFV降低≥10.83（对应1个自由度，P值<0.001）时，选择更复杂的模型。起始接种量的基线变异性使用B2方法处理，其中观察到的起始接种量被视为与残差误差相关的协变量，该残差误差与其他细菌计数具有相同的估计残差变异性。分析中纳入了所有可检测的细菌计数（n=3438），通常每个样本时间点和实验有1至3个观察值（稀释度）。所有细菌计数在数据分析前转换为自然对数。估计典型参数值和残差误差。未估计实验间变异性。经测试，纳入实验间变异性导致基线值设定错误并高估变异性。残差误差在对数尺度上为加性。为避免重复样本间相关性导致的偏倚，残差误差估计为同一实验中同一时间点的所有重复共用一个残差，以及一个重复特异性残差。通过从开发的模型及其参数估计（无不确定性）模拟1000次数据集复制，并基于模拟数据构建80%预测区间，用视觉预测检验（VPC）图评估模型性能。VPC按细菌菌株和药物浓度分层。模型预测和生成VPC的计算使用PsN执行，使用Xpose 4.4.2和R 2.10可视化。对于所有稀释度均低于LOD的同一时间点的样本，使用M3方法估计观察值低于LOD的概率。已证明考虑LOD数据的存在可减少参数估计的偏倚。

结果

时间-杀灭特征

当将环丙沙星浓度按各菌株MIC标准化时，野生型和突变体细菌的时间-杀灭曲线形状相似（图1）。对所有菌株而言，实验间的大部分变异性出现在0.25-1×MIC浓度。三重突变体（LM693）和四重突变体（LM707）的MIC最高（分别为32和48mg/L），在MIC附近浓度时的实验变异性也最高。观察到在所有0.5×MIC环丙沙星浓度的实验中，初始杀灭后3-6小时出现再生长（图1）。在较高环丙沙星浓度下，在部分但非全部实验中观察到实验结束时的再生长。在相同MIC倍数下，与任何突变体相比，野生型细菌的实验中更频繁地观察到再生长。在部分有再生长的研究中，注意到后期时间点的MIC增加。由于>48mg/L环丙沙星浓度的技术困难，未生成LM693（gyrA S83L、gyrA D87N和parC S80I）或LM707（gyrA S83L、gyrA D87N、parC S80I和marR）>1×MIC的数据。

图1. 大肠杆菌MG1655野生型及六个特征明确突变体的视觉预测检验（VPC）。（a）完整模型的模型拟合；（b）EC50/MIC相关模型的模型拟合。每个面板包括所有观察值（o），即至少三个不同实验的所有可检测细菌稀释度，黑色实线代表模拟中位数。低于虚灰线的观察值低于LOD，绘制为0.15×LOD（1.5）。从最终模型进行1000次模拟以构建80%预测区间，代表估计的及由此预期的实验变异。

流式细胞术与细胞形态

使用流式细胞术研究对照（无药物）和0.5×及1×MIC环丙沙星浓度下培养物中细菌颗粒大小随时间的变化。结果显示，0.5×和1×MIC下的颗粒大小在1-4小时之间与对照相比有所增加。在0.5×MIC下，颗粒大小在4小时后明显下降，而在1×MIC下，4小时后颗粒大小的下降不太明显（图4a）。

使用oCelloScope在0.5×MIC下研究24小时的细胞形态，观察到较长的大肠杆菌链，表明存在丝状化（图4b）。

图4. （a）LM347菌株的荧光激活细胞分选结果，y轴为相对细菌密度，x轴为前向散射光高度（FSC-H），对应颗粒（细菌）大小。（b）oCelloScope图像显示LM347菌株在0.5×MIC环丙沙星下24小时的细胞形态。

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