基于革兰氏阳性菌生长曲线等指标评价纤维素基抑菌材料L-Met改性MCC（M-MCC）抑菌效果（一）
摘要：为有效预防、处理食品中的微生物污染，本研究以微晶纤维素（microcrystalline cellulose，MCC）为原材料，通过L-甲硫氨酸（L-methionine，L-Met）负载，制备得到了具有抗菌效果的L-Met改性MCC（M-MCC）。通过微观形貌、元素组成分析等表征改性后M-MCC的形貌变化、元素变化以及稳定性，证明了L-Met成功接枝。对M-MCC的体外抗氧化能力进行研究，发现其对2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2，2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基有良好的去除效果，当M-MCC的质量浓度为20 mg/mL时，对ABTS阳离子自由基的清除率达到97.47%。而后通过最小抑菌浓度以及细菌生长曲线对M-MCC抑制单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的效果进行研究。确定了M-MCC对L.monocytogenes和S.aureus等革兰氏阳性菌有着较好的抑制效果，最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为15 mg/mL和30 mg/mL。最后，以L.monocytogenes和S.aureus为指示菌，研究了M-MCC对指示菌细胞膜通透性、细胞膜完整性、细胞内容物以及DNA含量等多个方面的影响。相关结果表明，M-MCC处理对L.monocytogenes和S.aureus的生长有显著的抑制效果，到达对数生长期的时间相较无处理组有所推迟。相应的胞外电导率、核酸和蛋白质的含量都有着明显的变化，且与处理时间密切相关。本研究表明M-MCC在抗菌应用方面具有巨大潜力。
革兰氏阳性菌是能被革兰氏染色为深蓝色或紫色的细菌，其细胞壁中含有大量的肽聚糖。由革兰氏阳性菌引起的感染可能导致许多严重的疾病，包括败血症、菌血症、肺炎和心内膜炎等。其中单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是食品中常见的革兰氏阳性菌。L.monocytogenes在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是L.monocytogenes的感染源。S.aureus感染引起中毒的食品种类较多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。L.monocytogenes每年导致全球约23 000例严重感染，易感人群的死亡率超过30%。2018年，欧盟共有2 549例侵入性L.monocytogenes确诊病例，每10万居民中有0.47例，1 469例确诊病例中死亡率为15.6%，是所有食源性疾病中死亡率最高的。金黄色葡萄球菌是一种共生细菌，可在人类的皮肤、鼻子和肠黏膜上繁殖。无病征的工人可透过人手接触或呼吸道分泌物污染食物，因而成为葡萄球菌导致食物中毒的源头。这种肠道中毒是因进食受产生肠毒素的金黄色葡萄球菌污染的食物而导致。细菌血症、感染性心内膜炎、骨关节、皮肤和软组织感染以及器械相关感染是金黄色葡萄球菌引起的主要疾病。食源性疾病带来的负面影响不仅局限于某个人或某一处地方，其会深入到生活的各个方面，食品的微生物污染问题也逐渐成为所有人共同关注的焦点。因此，如何快速有效地杀灭食品中的致病微生物，确保食品安全，对消费者及社会各方都具有十分重要的意义。食品中微生物的抑制和去除方法也成为许多研究者不断研究的课题。
为提高食品包装的抑菌能力，通常在包装中添加抑菌材料。常用的抑菌材料可分为无机抑菌材料和有机抑菌材料。一些无机化合物具有一定的抗菌活性，如银（Ag）、铜（Cu）、锌（Zn）等以及相应金属氧化物。此外，纳米颗粒和纳米技术也多用于无机抗菌材料。无机抗菌材料最重要的特点是在热等的条件下具有很好的稳定性。同时，无机抑菌材料也存在抗霉菌活性弱的缺点，因此在工业应用时通常会加大使用剂量。有机抗菌剂对某些生物分子具有特异性。这一特性使其在医疗、保健、食品包装薄膜等领域的应用更加广泛。有机抗菌剂又分为天然抗菌剂和合成抗菌剂两大类。天然抗菌剂主要包括精油类、溶菌酶类、壳聚糖类、细菌素类和酚类。合成抑菌剂包括季铵盐和其他活性物质负载聚合物复合材料。目前，抗菌剂的发展方向除了探索开发天然抗菌剂外，更多的是将天然抗菌剂负载在聚合物材料上，从而在保留抑菌剂活性的条件下达到增强其机械性能的效果。近年来，由于纤维素独特的结构和性质，例如无毒环保、生物相融性好、可再生性强等特点，又具备比表面积大、纳米结构精细、力学强度良好和热膨胀系数较低等特点，纤维素可作为一种理想的新型食品载体材料，被广泛应用于包括食品、造纸、生物材料和制药行业的许多领域。
纤维素来源广泛，年产量约为500亿t。纤维素是由β-D-吡喃葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的线性高分子化合物，具有良好的亲水性和化学修饰性，是自然界中最丰富的生物大分子材料，是最适合合成绿色产品的原料之一。近年来，纤维素基抗菌剂的研究逐渐成为抗菌研究的热门。纤维素可以作为性能优良的载体，运用不同的改性方法能够使纤维素在具备较好抗菌效果的同时满足差异化的需求。氨基酸是生物大分子蛋白质的基本组成单位，是一类同时含有碱性氨基和酸性羧基的两性化合物，目前一共有22种氨基酸。按照人体能否自行合成，可将氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸。氨基酸的结构基本类似，性质的不同主要体现在R基的不同。甘氨酸的R基为—H，不具备立体异构体，除甘氨酸外的所有氨基酸都具备立体异构体，即存在D-型和L-型两种构型。氨基酸被广泛应用于食品和医药产业。氨基酸具有丰富的官能团，且大部分氨基酸具有良好的水溶性，是纤维素改性的一个良好选择对象。
一些研究如含有五倍子草提取物的高吸水性交联羧甲基纤维素-聚乙二醇水凝胶（最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为0.24 mg/mL）和由聚己内酯及醋酸纤维素制成、添加精油的同轴湿纺纤维（对S.aureus的MIC为2.06 mg/mL）虽然具备较低的MIC，但一般都用于医学领域作为体外伤口敷料，难以运用在食品中。此外，这些材料的制备还存在着提取困难、合成复杂等问题。相较于其他材料，纤维素和氨基酸均为绿色无害的天然化合物，可以广泛应用于食品中，且合成原料便于获取、成本较低，通过高碘酸钠氧化接枝的合成途径和条件也较为简单。
本研究以食品中常见的L.monocytogenes和S.aureus两种革兰氏阳性菌为研究对象，以微晶纤维素（microcrystalline cellulose，MCC）为载体，L-甲硫氨酸（L-methionine，L-Met）为改性材料，设计开发一种纤维素基抑菌材料L-Met改性MCC（M-MCC）。通过L.monocytogenes和S.aureus生长曲线等指标评价M-MCC的抑菌效果，通过测定M-MCC处理后细胞膜通透性等指标以评价M-MCC对L.monocytogenes和S.aureus细胞膜的影响。
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