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大肠埃希菌的菌落数范围、贮藏条件、活性及性状的稳定性【实验】

来源:科技创新与应用 发布时间:2024-11-29 15:52:05 浏览:50 次

摘要:大肠埃希菌在4°中贮藏,其作为实验菌的活性。连续31天进行大肠埃希菌计数和特征实验,进而验证其数量及性状的稳定性。结果表明,在连续31天的实验中,大肠埃希菌的菌落数范围在1.5×109cfu/ml~8.7×109cfu/ml,且菌落大小、形态特征、指示反应等情况均体现出该菌种应有特性。实验证明,在4°冰柜贮藏条件下,大肠埃希菌能够作为对照菌进行控制菌检查法实验。


依据《中华人民共和国药典》2015版,非无菌产品微生物限度检查中的控制菌检查法,需进行阳性对照试验,每次试验均需要加入不大于100cfu的对照菌。依据药典指导原则,菌种可采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻(低于-30℃)等保存方法。使用以上方法保存菌种,则需在每次实验前都要进行菌种活化和计数实验,进而配制不大于100cfu的加菌量。本公司药品均进行微生物限度检查,其中含有大肠埃希菌项目。为提高检验效率,寻找适宜的菌种贮藏方法,同时结合本实验室实际情况,将大肠埃希菌经复苏后接种至胰酪大豆胨液体培养基中,24h菌种活化后,4°C冰柜里贮藏。随后每日进行菌种数量及性状验证,为进行大肠埃希菌的贮藏提供有益的科学探讨。


1材料与方法


1.1仪器与材料


BPX-272型电热恒温培养箱;YSQ-LS-75SII型立式压力蒸汽灭菌器;生物安全柜;大肠埃希菌[CMCC(B)44102]购自中国食品药品检定研究院;实验所用培养基。


1.2实验方法


1.2.1菌液制备:复苏后的大肠埃希菌菌种(不超过5代)移至胰酪大豆胨液体培养基置培养箱中30~35°C培养24h,培养后贮藏至4°C冰柜。


1.2.2菌种计数:取1ml菌液用pH7.0蛋白胨缓冲液逐级稀释至10-10,取各级稀释菌悬液1ml,置直径90mm的无菌平皿中,注入15~20ml温度不超过45°C熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基,混匀,凝固,倒置培养。30~35°C培养24h,然后用µCount3D微生物计数仪计数。


1.2.3性状验证:10-8稀释级菌液大肠埃希菌接种于麦康凯液体培养基(42~44°C培养24h)和麦康凯琼脂培养基(30~35°C培养24h)中,观察培养基上大肠埃希菌生长情况。


2实验结果


2.1菌种计数实验结果

由表1可以看出,大肠埃希菌在4°C冰柜里贮藏,连续31天的菌落数范围在1.5×109cfu/ml~8.7×109cfu/ml之间。


2.2性状验证实验结果

由表2可以看出,大肠埃希菌在4°C冰柜里贮藏,连续31天取菌液量均不大于100cfu,加入麦康凯液体培养基和麦康凯琼脂培养基中,培养基体现的菌落大小、形态特征、指示反应等情况均体现出大肠埃希菌应有特性(+表示)。


综上,将大肠埃希菌在4°C冰柜里贮藏,连续31天进行计数和性状实验。结果表明,取10-8稀释级菌液,每ml菌液量均不大于100cfu,这可用于大肠埃希菌检测阳性对照试验的加菌量,无需每次进行验证。同时,每ml10-8稀释级菌液也能够表现出大肠埃希菌應有特性。由此证明,每次进行大肠埃希菌实验,可直接用贮藏菌液稀释至10-8,取1ml作为阳性对照实验的加菌量。


3讨论


药品微生物限度检查是控制药品质量的一个重要检查项目,其中控制菌检查是必须进行的检验项目。控制菌检查过程中,需要添加不大于100cfu阳性菌进行阳性对照实验。按照冷冻法活化新鲜菌种,进而制备试验菌,其工作量较大,周期较长。现采用4°C冰柜贮藏大肠埃希菌菌液,每次可以直接进行稀释使用,提高工作效率,同时也可保障检验的顺利进行。本文只对大肠埃希菌进行实验,其他菌种(铜绿假单胞菌、沙门菌等)未进行相关实验,故是否能应用于所有控制菌实验还需进一步研究。


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