甘肃陇南油橄榄叶提取物对几种常见细菌生长曲线的影响
随着抗生素类和磺胺类等抗菌药物的大量使用，细菌的耐药性不断增强。因此，研发高效、广谱、低残留、低毒的药物将成为防治细菌感染类疾病的重中之重。研究发现中药或天然植物提取物可抑制或直接杀灭病原菌而不产生耐药性[6-7]，因此抗菌中药逐步成为研究热点。而橄榄苦苷作为一种裂环烯醚萜类化合物，对细菌具有较强的抑制效果。本文以甘肃陇南油橄榄叶提取物(Olive leaves extract，OLE)为试样，分析其对几种常见细菌的抑菌活性，为油橄榄叶提取物制备成抗菌制剂提供实验依据和理论基础。
测试方法
采用稀释法[10]分析OLE对8种供试细菌生长曲线的影响。依次将菌悬液和不同质量浓度的OLE溶液加入灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、160 r/min振荡培养。每隔6 h置于超净工作台内取样一次，于540 nm波长处测定其吸光度，绘制细菌生长曲线。
测试结果
OLE对芽孢杆菌生长曲线的影响(见图1)
注：A为蜡状芽孢杆菌，B为枯草芽孢杆菌。
由图1(A)可知，在不添加OLE的培养基中，蜡状芽孢杆菌在培养12 h后细菌生物量的积累明显加快，12～30 h为蜡状芽孢杆菌的对数生长期。添加OLE质量浓度为5 mg/mL溶液的培养基中蜡状芽孢杆菌在培养18 h后适应环境并快速繁殖，在18～24 h处于对数生长期，与对照组比较，此时细菌的对数生长期相对延缓，说明OLE对蜡状芽孢杆菌的生长有一定的抑制作用。当添加OLE质量浓度为10 mg/mL的溶液时，培养到18 h后蜡状芽孢杆菌开始迅速增长，在培养18～24 h时处于对数生长期，但菌体浓度低于5 mg/mL组，表明蜡状芽孢杆菌随着OLE质量浓度的增加，对数生长期被相应延缓或推迟。由图1(B)可知，当不添加OLE时，培养到6 h后枯草芽孢杆菌开始增长，在培养6～30 h时处于对数生长期。OLE质量浓度为5 mg/mL时，在培养18 h后枯草芽孢杆菌快速生长并进入对数生长期。在OLE质量浓度为10 mg/mL时，培养24 h后枯草芽孢杆菌增长明显加快，24～30 h为快速生长期。表明随着OLE质量浓度的增加，枯草芽孢杆菌的延迟期增长，对数生长期延后。实验发现蜡状芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌对数生长期分别为12～30 h、6～30 h，添加不同质量浓度的OLE后均可延缓蜡状芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌进入对数生长期。生长曲线迟缓期的长短主要因菌种、接种量、菌龄及营养物质等不同而异。本实验中迟缓期延长的原因可能是OLE中的活性成分作为菌体生长的抑制剂对其生长起到了抑制作用。
OLE对大肠杆菌生长曲线的影响(见图2)
注：A为抗四环素大肠杆菌，B为大肠杆菌。
由图2可知，抗四环素大肠杆菌组和大肠杆菌组的生长曲线趋势趋于一致。不添加OLE时，培养6 h后细菌数开始快速增长并进入对数生长期。当OLE质量浓度为5 mg/mL时，抗四环素大肠杆菌和大肠杆菌的对数生长期为18～30 h，此时对数生长期被延缓，细菌生长速率减慢且所需时间范围变宽。当OLE质量浓度为10 mg/mL时，抗四环素大肠杆菌和大肠杆菌在培养18 h后细菌数迅速增加，在18～30 h为对数生长状态，但菌体浓度低于5 mg/mL组。图2(A)表明添加OLE既可以延缓抗四环素大肠杆菌进入对数生长期的时间，又可以降低其菌体生长量，OLE对该菌株有较强的抑制作用。图2(B)表明OLE对大肠杆菌的抑制作用相对较弱。油橄榄叶中酚类物质具有抗肿瘤、抗癌作用，此外还有广泛的抑菌和抗氧化作用，如橄榄苦苷、芦丁、咖啡酸等及其一定比例混合物均显示较强的体外活性，具有联合抗菌作用。Lee等[14]发现橄榄叶提取物中的橄榄苦苷和咖啡酸均表现出对微生物的抑制作用，且组合酚类化合物的抗菌效果显着高于酚类化合物单体。
OLE对葡萄球菌生长曲线的影响(见图3)
注：A为表皮葡萄球菌，B为金黄色葡萄球菌(SH7)，C为金黄色葡萄球菌。
由图3(A)可知，不添加OLE的培养基中表皮葡萄球菌培养12 h左右进入对数生长期，培养24 h时进入平稳期，之后细菌数开始快速降低。OLE质量浓度为5 mg/mL时，表皮葡萄球菌在培养18 h之后细菌数增加较快，18 h左右进入对数生长期，培养30 h后达到最大菌液浓度，此时表皮葡萄球菌对数生长期相对对照组被延缓，说明OLE对表皮葡萄球菌有一定抑菌作用。在OLE质量浓度为10 mg/mL时，表皮葡萄球菌在培养6 h后繁殖较快，数目增加明显，18 h左右进入对数生长期，培养30 h后细菌数开始下降。由图3(B)可知，当不添加OLE时，金黄色葡萄球菌(SH7)在开始培养后持续快速增长。OLE质量浓度为5 mg/mL时，培养6 h细菌开始适应环境，12 h后快速生长，对数生长期出现在培养12～36 h之间。OLE质量浓度为10 mg/mL时，金黄色葡萄球菌(SH7)生长曲线趋势与5 mg/mL组相一致。由图3(C)可知，不添加OLE时，培养6 h后金黄色葡萄球菌进入对数生长期。OLE质量浓度为5 mg/mL时，培养12 h后金黄色葡萄球菌菌数开始增加，18 h后进入对数生长期，相比对照组，此时对数生长期被延缓，细菌生长速率减慢。当OLE质量浓度为10 mg/mL时，金黄色葡萄球菌在培养18 h后细菌数迅速增加，于18 h达对数生长状态。以上结果表明，OLE对葡萄球菌生长曲线的对数生长期均具有延缓作用。吴遵秋等[12]利用稀释法分析了橄榄苦苷对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌生长曲线的影响，结果显示橄榄苦苷对3种细菌生长曲线的影响均表现为延缓细菌的对数生长期，与本研究结果类似。植物源提取的酚类物质具有广谱的抑菌性，特别是黄酮类化合物，从不同物种中提取的黄酮类化合物抑菌作用均不相同。橄榄黄酮对变形杆菌有较强的抑制作用，对痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用更强；橄榄黄酮对牛乳中微生物的活动同样具有抑制作用，而且随着橄榄黄酮浓度的增加，抑菌作用明显增加[15]。OLE对细菌对数生长期的延缓作用是其中多种活性物质相互协同作用的结果。
OLE对铜绿假单胞菌生长曲线的影响(见图4)
图4不同质量浓度OLE对铜绿假单胞菌生长曲线的影响
由图4可知，与对照组相比，当OLE质量浓度为5 mg/mL时，对铜绿假单胞菌的生长抑制作用较小，但是当OLE质量浓度增至10 mg/mL时，生长抑制作用较明显，尤其是在生长后期。结果表明在实验质量浓度范围内，OLE对铜绿假单胞菌的生长抑制作用与其质量浓度直接相关。已有的研究显示橄榄黄酮和橄榄多酚对杆菌、葡萄球菌均有较强的抑制作用，且随着浓度的增加抑菌作用明显增加[15-16]。因此，橄榄叶提取物中有效成分浓度与抑菌活性之间存在显着的正相关性。