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铜绿假单胞菌适配体的筛选和裁剪【研究进展】

来源:生物技术通报 发布时间:2024-07-15 22:34:44 浏览:8 次

铜绿假单胞菌是一种专性需氧的革兰氏阴性菌,是引起人类机会性感染的最主要的微生物,对人类造成多种健康威胁。因此,快速、灵敏、特异的检测对预防及治疗铜绿假单胞菌感染十分关键。目前常规的检测方法仍存在耗时久、成本高、操作难度大等问题,因此需要更加高效经济的检测方法。适配体是一种从随机文库中筛选出来的寡核苷酸,能够形成多种复杂的二级结构,近年来,由于其易于合成和修饰,并且具有高亲和力和强特异性而受到了广泛的关注,也涌现出了大量基于适配体的铜绿假单胞菌检测和防治的研究。


适配体是通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)得到的具有特异性识别能力的人工合成寡核苷酸序列,1990年首次通过体外筛选被开发[8]。适配体一般为几十个碱基构成的DNA或者RNA序列,目前已经有超过千项的适配体筛选研究被报道[9]。适配体的可识别靶标十分丰富,包括重金属、细胞、蛋白质等多种物质[10]。由于其具有高亲和力、高特异性且易于合成和修饰等特点,得到了广泛的研究。


本文总结了目前铜绿假单胞菌适配体的筛选和裁剪方面的研究进展。


铜绿假单胞菌的筛选和裁剪


高性能适配体的获得是实现多领域应用的基础,为了获得更好的适配体,往往需要进行筛选和裁剪。在适配体的筛选中,首先对寡核苷酸文库进行制备,并将含有随机寡核苷酸数量超过1014以上的RNA或者DNA文库与靶标物质进行孵育,经过一定时间的反应后,将可以与靶标结合的核酸序列与未结合的核酸序列进行分离,对于可结合靶标的核酸,通过PCR等方式对其进行扩增,以生成新的寡核苷酸库。重复以上步骤5-15次后对富集文库进行测序,并通过多种技术对测序得到的序列进行亲和力和特异性分析,最终从数量庞大的文库中得到具有优越性能的适配体序列用于下一步的传感器开发(图1)[11⇓-13]。尽管通过几轮甚至十几轮的筛选,可以从中获得较好的核酸序列,但是由于随机文库筛选中固有的局限性,即使随机文库中已经具有相当多数量的核酸序列,筛选获得适配体序列依然可能存在部分碱基在特异性的识别中不能发挥积极的作用,因此通过裁剪对这些冗余的碱基进行去除或对有效碱基进行重复有助于获得性能更优的适配体。目前,针对铜绿假单胞菌已有多种适配体得到了开发和应用,除了以微生物适配体筛选中常见的全细胞作为筛选靶标外,铜绿假单胞菌的外毒素A和脂多糖也被用作靶标进行相关适配体的筛选(表1),多种铜绿假单胞菌靶标适配体的筛选为其检测提供了更加广泛的可能性。此外,在已经筛选的铜绿假单胞菌适配体中,既包括DNA适配体,也包括RNA适配体。

图1 SELEX流程图

表1铜绿假单胞菌适配体的筛选


全菌是微生物适配体筛选中最常见的靶标,利用菌体较大的特点,通过离心操作可以有效的分离结合序列和未结合序列,在铜绿假单胞菌的适配体筛选中,既包括了以死菌为靶标的适配体筛选,也包括了以活菌作为靶标的筛选。2011年,Wang等[14]首次对铜绿假单胞菌的适配体进行了筛选,经过15轮的筛选,文库通过流式细胞术测定的结合能力不再继续增加,因此结束筛选进行核酸测序,经过测序得到了亲和力为(17.27±5.00)nmol/L的适配体序列。2017年,Soundy等[15]首次针对活的铜绿假单胞菌开展了适配体的筛选。经过7轮的全细胞筛选,对荧光标记的适配体进行流式细胞术分析,第7轮文库与靶标的结合效果与初始文库相比有了显著的增强,经过测序得到了适配体序列JN08和JN27,经过二级结构预测,JN27中单个茎环为唯一显著的稳定结构。因此对该茎环部分单独进行序列合成,并通过流式细胞术进行结合效果的评估,结果验证具有茎环结构的适配体序列具有较好的结合效果,是筛选得到的长适配体序列的核心结合区域。


除了对全菌进行筛选,铜绿假单胞菌的毒力因子也已经作为靶标物质开展了适配体的筛选。外毒素A是铜绿假单胞菌重要的毒力因子,也是其感染的重要标志物。Hong等[16]利用诱饵SELEX(Decoy-SELEX)对外毒素A的适配体进行筛选。在筛选中牛血清白蛋白和霍乱毒素作为负筛靶标使用,经过14轮的筛选对测序得到的适配体序列,利用表面等离子共振进行亲和力的检测,得到Kd值为4.2-4.5μmol/L。此外,Ye等[17]基于Capture-SELEX技术筛选得到了适用于包括铜绿假单胞菌在内的多种菌脂多糖检测的适配体,其长度为80 nt,由于较长的核酸序列难以从石墨烯表面进行释放,进一步对其进行裁剪,并利用等温量热滴定法对其亲和力进行评估,最终确定了27 nt的最佳适配体,该适配体可以对鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的脂多糖进行识别和结合,并且在裁剪中亲和力从(102±17)nmol/L上升至(46.2±9.5)nmol/L。


除了这些DNA适配体,铜绿假单胞菌的RNA适配体也得到了开发。与DNA适配体相比,RNA适配体尽管稳定性稍差但在内化至细胞方面更具优势。利用氟修饰的RNA文库,Davydova等[18]筛选得到了可以内化到细菌细胞中的适配体,测序后发现,该适配体与铜绿假单胞菌rRNA片段相同,进一步佐证了该适配体可以内化至细菌细胞的可能性。



绘制铜绿假单胞菌生长曲线【检测步骤】

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