巨大芽孢杆菌BM24生长曲线、耐药性、益生潜力评估及药敏试验（一）
摘要
本试验旨在评估一株从健康细毛羊粪便中分离得到的巨大芽孢杆菌BM24的体外益生潜力及体内安全性。采集饲养过程中没有添加抗生素的健康新疆细毛羊的新鲜粪便，先通过形态学鉴定、生化鉴定、16S rRNA测序，初步获得羊源芽孢杆菌菌株，后续通过对酸和高浓度胆盐环境的耐受性，以及菌株的体外抗菌能力、耐药性、溶血活性和生长曲线等方面的检测，初步判断分离出的芽孢杆菌菌株的体外安全性，最后进行小鼠体内试验，评估其安全性。结果表明:1)初步分离得到1株羊源芽孢杆菌，结合生化鉴定和测序结果确定为巨大芽孢杆菌，将其命名为巨大芽孢杆菌BM24;2)该菌株可在pH=1.0条件下存活，0.3%胆盐培养4 h后存活率为49%，在15种常见抗生素中对12种抗生素高度敏感，对常见腹泻致病菌沙门氏菌和大肠杆菌抑制效果较好，无溶血活性;3)该菌株在37℃培养2 h后进入生长对数期，6 h后进入生长平稳期;4)灌胃该菌株后小鼠无死亡、体重变化正常，剖检体腔脏器无眼观病理现象，对肝脏、肾脏、脾脏指数及血细胞指标均无显著影响(P>0.05);腹腔注射该菌株，小鼠体征正常、无死亡现象，体腔脏器无眼观病理变化。综上可知，本试验分离得到的羊源巨大芽孢杆菌BM24具有良好的体外益生潜力，且无急性毒性作用，可作为羊源益生菌的候选菌株。
近年来，由于养殖业中抗生素的过度使用，导致耐药菌株增多、药物残留、污染环境、甚至危害人体健康等问题频发，2020年7月，我国开始全面禁止使用促进生长的抗生素作为饲料添加剂，因此开发绿色健康的饲料添加剂是大势所趋，已有研究证明益生菌可作为常规抗生素饲料添加剂的替代品，发挥调节动物的肠道微生态平衡、增强动物免疫功能、促进消化与吸收、提高动物的生产性能等有益作用。
芽孢杆菌是一类能够在逆境下形成内生孢子以抵制不良环境的饲用益生菌，正是因为芽孢杆菌能够产生内生孢子的这一特性，使得其相较于其余几种常用益生菌更具优势，目前畜禽业饲料添加剂中广泛应用的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)作为芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性杆菌，常见于土壤、植物表面和水底沉淀物中，具有解磷固氮、消除异味、净化水体、改善养殖环境、提高机体免疫力、改善动物生长性能等作用。Yao等研究发现，巨大芽孢杆菌可改善哺乳犊牛的生长性能，提高免疫功能及肠道氧化状态;贡笑笑等研究发现，土壤来源的巨大芽孢杆菌1259制剂能够促进山羊瘤胃细菌丰度以及肠道中有益微生物的增殖，提高荷斯坦奶牛标准乳产量;饲料中添加60 mg/kg巨大芽孢杆菌1259可显著增加56日龄扬州鹅体重，缩短出栏时间，提高经济效益。
研究显示，微生物的益生特性与宿主种属特异性有关，同一宿主来源的微生物更易于在该宿主肠道定植并表达其生物活性，并可改善宿主的生长性能与肠道健康。目前，国内外尚未见羊源益生性巨大芽孢杆菌的相关报道。因此，本研究拟从成年健康新疆细毛羊粪便分离出具有拮抗病原菌、对抗生素敏感的潜在益生性芽孢杆菌，并评估其耐受性、溶血活性、体内安全性，目的是为羊源益生性芽孢杆菌的开发提供参考，也为羊用微生态制剂在新疆养羊业中的应用提供理论支持。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1粪便样品和试验动物
粪便样品来源于新疆农业大学动物医学学院试验基地饲养的成年雄性新疆细毛羊，饲粮为精饲料和苜蓿，自由饮水，并经兽医健康认定无抗生素使用史。无特定病原体(SPF)级雄性昆明小鼠，共20只，体重(26±2)g，购自新疆医科大学实验动物中心，自由采食和饮水。
1.1.2主要试剂及供试菌株
LB肉汤及琼脂培养基、HBI芽孢杆菌生化鉴定条购自青岛海博生物技术有限公司;脱纤维绵羊血、牛胆盐购自北京索莱宝科技有限公司;细菌药敏纸片(批号:20172400206)为杭州滨和微生物试剂有限公司产品;牛源大肠杆菌K99、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌菌株为新疆农业大学动物医学学院临床产科实验室保存菌株。
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