基于全细胞生长的 GAT 生长耦合策略，突破合成肌酸过程中的代谢瓶颈
肌酸是一种通过肌酸/磷酸肌酸系统在脊椎动物中作为能量储存和缓冲系统的分子，其中磷酸基团通过酶促反应在ATP和肌酸之间转移。该分子在肌肉发育和神经生理性能中发挥重要作用。人类内源性肌酸合成量（约1克/天）仅能满足每日需求的一半（约2克/天），因此需要补充。然而，肌酸仅存在于动物性食物中，这突显了植物性饮食中替代肌酸补充的重要性。目前市场上销售的肌酸是通过化学合成生产，严重依赖于化石燃料基的原材料，成本较高。此外，由于残留的氰胺衍生物可能导致食品污染，其去除过程会显著增加下游工艺的成本。
近日，期刊《Metabolic Engineering》上发表了研究论文“Microbial production of creatine using growth-coupled selection systems”，使用表达异源途径的大肠杆菌细胞工厂开发生物合成过程，作为一种化学合成的替代方案。并采用了一种基于模型的生长耦合选择方法，结合适应性实验室进化，以克服异源合成肌酸过程中的代谢瓶颈。
经过多次设计-构建-测试-学习的进化与选择循环，与对照菌株相比，从甘氨酸和精氨酸合成的肌酸产量提高了58%。脊椎动物中肌酸由精氨酸和甘氨酸经两步酶促反应合成，即甘氨酸脒基转移酶（GAT）将两者转化为鸟氨酸和胍基乙酸（GAA），胍基乙酸甲基转移酶（GAMT）利用辅因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将GAA甲基化生成肌酸。研究团队在大肠杆菌中组装了该途径，筛选并密码子优化了8种GAT和4种GAMT酶，发现GAT8与GAMT4组合的生产效果最佳。
在该研究中，甘氨酸脒基转移酶（GAT）是肌酸生物合成途径的关键限速酶，研究团队通过两种生长耦合策略对其进行优化，核心内容如下：设计1：基于全细胞生长的GAT生长耦合策略设计思路该策略旨在通过代谢网络重构，将GAT的催化活性与大肠杆菌的生长直接关联——即GAT活性越高，细胞生长越好，从而实现高效筛选。具体设计基于基因组尺度代谢模型：
·让精氨酸和甘氨酸作为唯一碳源，GAT催化二者生成鸟氨酸；
·通过异源表达鸟氨酸环脱氨酶（OCD），将鸟氨酸转化为脯氨酸，而脯氨酸作为碳源和能量来源参与生物量合成；
·敲除可能绕过GAT反应的替代途径，确保GAT活性是鸟氨酸生成的唯一途径，进而成为生长必需条件。
实验挑战与失败原因
·OCD活性不足：初始使用的OCD突变体（OCDv1）催化效率低，无法将鸟氨酸有效转化为脯氨酸，导致细胞在鸟氨酸作为碳源时无法生长；通过适应性实验室进化仍未解决核心问题。
·精氨酸对OCD的抑制：精氨酸与鸟氨酸分子结构相似，会竞争性结合OCD的活性位点，抑制其催化功能。当精氨酸浓度较高时，OCD几乎失活，导致GAT与生长的耦合关系断裂，最终该设计失败。
设计2：基于脯氨酸营养缺陷的GAT生长耦合策略（优化后）设计思路由于设计1中“全生物量生长耦合”对GAT活性要求过高，且受精氨酸抑制影响显著，团队改为“弱耦合”策略——仅将GAT活性与细胞对脯氨酸的基础需求关联，降低代谢负担：
·敲除脯氨酸合成基因（ΔproB），使细胞成为脯氨酸营养缺陷型，必须依赖外源脯氨酸或通过鸟氨酸转化获取；
·同时敲除鸟氨酸内源合成基因（ΔargA），确保鸟氨酸只能通过GAT催化精氨酸和甘氨酸生成，进而转化为脯氨酸满足生长需求；
·该设计大幅降低了对GAT的通量要求，且通过调控精氨酸浓度可避免OCD抑制，使GAT活性与生长的耦合关系稳定。筛选结果通过该策略对GAT随机突变库进行筛选，获得3种高效GAT变体（GAT8_v1、v2、v3）：
·这些变体的突变位点集中在预测的α螺旋和底物结合口袋，可能通过改变蛋白结构增强催化效率；与野生型GAT8相比，其胍基乙酸（GAA，肌酸直接前体）产量提升73%-94%，最终使肌酸产量较基准菌株提高58%，达到100 mg/L以上。
随后，作者发现胞内肌酸积累会抑制大肠杆菌生长，通过适应性实验室进化（ALE），在逐步提高胍基乙酸（GAA）浓度的条件下进化菌株，获得的耐受菌株与优化的GAT变体结合后，肌酸产量较基准菌株提升58%，达到100 mg/L以上。该研究成功在大肠杆菌中重构了肌酸生物合成途径，通过生长耦合选择系统与适应性实验室进化结合，克服了代谢瓶颈和产物毒性问题，为替代化学合成、实现肌酸可持续生产奠定了基础，也为生物制造中生长耦合生产系统的开发提供了参考。
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