微生物生长曲线系统评估黑曲霉孢子在不同铜离子浓度下的生长情况
研究背景：真菌污染在各种工业和环境环境中仍然是一个持续的挑战。表明真菌感染和霉菌传播带来的威胁越来越大，无论是在数量还是严重程度方面。为了减轻这种风险，必须制定和实施有效的预防策略，旨在抑制真菌孢子的传播和生长，特别是在临床环境和狭窄建筑空间等关键环境中。近年来由于丝状真菌对不断变化的环境条件的适应性，越来越被认为是人类健康和农业的主要问题。最近的研究进一步表明，尤其是全球变暖正在改变丝状真菌和酵母的耐热性。本研究聚焦于黑曲霉孢子对铜表面的应激反应及其对抗霉表面功能化的影响。真菌污染在医疗、农业和工业领域是一个持续存在的挑战，因为真菌具有很强的环境适应性和对杀菌剂的抗性。
为了应对这一问题，研究者们利用超短脉冲激光诱导的周期性表面结构（USP-DLIP）技术，对铜、黄铜和钢表面进行功能化处理，设计了3微米和9微米的拓扑结构，以评估其抗真菌效果。研究方法包括铜离子释放量的测量、扫描电子显微镜（SEM）分析、湿接触杀灭实验以及代谢活性测试。结果显示，9微米周期的铜表面结构能够实现99%的孢子活性降低，表明铜离子释放增加是增强抗真菌效果的关键因素。SEM分析确认了孢子在铜表面的显著损伤，而钢表面的孢子则相对完整。代谢活性测试表明，接触过铜、黄铜和钢表面的孢子显示出更快的代谢活性恢复。此外9微米结构的铜表面在抗真菌效果上优于3微米结构，而黄铜和钢表面的抗真菌效果不显著。
研究结论指出，USP-DLIP技术处理的铜表面在抗真菌方面表现出显著效果，特别是9微米结构的铜表面能够显著降低黑曲霉孢子的活性。增加表面结构的复杂性可以提高铜离子的释放量，从而增强抗真菌效果。尽管黄铜和钢表面也经过了USP-DLIP处理，但它们的抗真菌效果不明显，这可能与铜离子的释放量和真菌对金属离子的耐受性有关。研究还强调了铜表面在实际应用中的长期稳定性和耐腐蚀性需要进一步研究。
丹麦Biosense微生物生长曲线监测系统的应用
oCelloScope是一种自动化微生物成像设备，用于评估黑曲霉（Aspergillus niger）孢子在不同铜离子浓度下的生长情况。oCelloScope通过定期拍摄孢子的生长情况，生成高分辨率的显微图像。这些图像用于观察孢子的萌发、菌丝生长以及形态变化。通过设备内置的SESA（Segmentation and Extraction of Surface Areas）算法能够自动分析孢子的生长曲线。通过计算孢子在不同时间点的生长面积。oCelloScope能够在长达30小时的实验期间持续监测孢子的生长情况，每隔30分钟拍摄一次图像。这种长时间的监测能力使得研究者能够全面了解孢子在不同铜离子浓度下的生长动态。将黑曲霉孢子暴露于不同浓度的CuSO₄溶液中，然后将这些孢子转移到含有最小培养基（MM）的96孔板中。使用oCelloScope拍摄孢子在30°C下培养30小时的生长情况。通过分析孢子的萌发和菌丝生长，发现随着铜离子浓度的增加，孢子的生长受到显著抑制。oCelloScope的自动化成像和分析功能大大提高了实验效率，减少了人为操作的误差。
实验结论
通过实验评估了超短脉冲激光诱导的周期性表面结构（USP-DLIP）对铜、黄铜和钢表面的抗真菌功能化效果，特别是针对黑曲霉（Aspergillus niger）孢子的应激反应。9微米周期的铜表面结构能够实现99%的孢子活性降低，表明铜离子释放增加是增强抗真菌效果的关键因素。SEM分析显示，铜表面的孢子出现显著的细胞壁破裂和形态塌陷，而钢表面的孢子则相对完整。增加表面结构的复杂性（如9微米结构）可以提高铜离子的释放量，从而增强抗真菌效果。3微米和9微米结构的铜表面在抗真菌效果上存在显著差异，9微米结构表现更优。铜表面在实验室条件下表现出良好的抗真菌效果，但在实际应用中，其长期稳定性和耐腐蚀性需要进一步研究。真菌（如黑曲霉）可能通过产生草酸等代谢产物加速铜表面的腐蚀，这可能影响铜表面的长期抗真菌效果。
图1、铜表面对微生物物种抗菌作用的简化方案，这里是真菌细胞的示例。A，B）铜离子从铜表面溶解并进入微生物（真菌细胞）壁和膜。通过与嵌入膜中的铜转运蛋白的直接相互作用或通过被动机制（如跨膜的电化学梯度）进行主动运输，导致膜电位和细胞质内容物的损失。铜离子在细胞内的积累必须达到一定的阈值才会变得有毒，这个阈值因生物体而异。C）不同的铜种类通过Fenton样反应诱导活性氧（ROS）的产生，基因组和质粒DNA降解，最终导致细胞死亡。
图2、在30°C（终点）下孵育30小时后，所有测试的CuSO4浓度（10×10、20×10、30×10、40×10、50×10m）以及两种菌株的未处理对照。比例尺对应于50μm
图3、以SESAfun规范[a.u].对应于A）野生型菌株和B）色素沉着突变菌株随时间变化的真菌质量。阳性（未处理的）真菌孢子显示为绿色。
图4、A）A.niger野生型N402孢子和B）A.niger色素沉着突变菌株（MA 93.1）在与相应的功能化表面接触30、60和120分钟后的存活数据。存活分数（N/N0）是相对于未暴露的孢子计算的（与金属表面没有任何接触的初始孢子浓度）。
图5、与结构化（3μm）铜、黄铜和钢以及未经处理的孢子接触后，孢子生长和发芽过程中代谢活性的发育，没有任何金属表面接触。代谢活性测量为A）A.niger野生型N402孢子和B）A.niger色素沉着突变菌株（MA 93.1）与3μm USP-DLIP功能化表面接触120分钟后刃天青（%）的相应减少。将阳性对照的代谢速率与处理过的孢子进行比较，观察到以下显着性：A）钢3μm（p=0.010）、铜3μm（p=0.0007）和黄铜3μm（p=0.0006）。数据显示为平均值±标准误差（n=3）。值得注意的是，在野生型孢子（p=0.03）的12小时时观察到钢和铜表面之间的特异性显着差异，尽管由于随着时间的推移重叠的代谢趋势，这种差异很难可视化。B）钢3μm（p=0.006），铜3μm（p=0.010）和黄铜3μm（p=0.004）。
总结
USP-DLIP结构化铜表面显着增强了抗真菌功效，特别是针对野生型菌株，其中9μm结构导致真菌孢子活力显着降低。这凸显了表面结构作为开发先进抗菌材料的强大策略的潜力。研究结果表明，结构化地形会影响真菌活力，即使在非抗菌材料上也是如此，如在钢表面上观察到的轻微抗真菌效果所示。相比之下，黄铜表面的真菌活力没有表现出类似的降低，这可能是由于有毒铜离子的生物利用度有限和锌的同步释放，真菌可能会将其用作微量营养素，而不是将其作为压力源。
oCelloScope是一种自动化微生物成像设备，用于评估黑曲霉（Aspergillus niger）孢子在不同铜离子浓度下的生长情况，为研究黑曲霉孢子对铜离子的耐受性提供了有力的支持。oCelloScope通过定期拍摄孢子的生长情况，生成高分辨率的显微图像。这些图像用于观察孢子的萌发、菌丝生长以及形态变化。oCelloScope能够在长达30小时的实验期间持续监测孢子的生长情况，每隔30分钟拍摄一次图像。这种长时间的监测能力使得研究者能够全面了解孢子在不同铜离子浓度下的生长动态。
此外锌与铜的吸收竞争及其在草酸盐复合物形成中的作用可能会进一步减轻铜的毒性，从而有助于在黄铜表面观察到的抗真菌作用减弱。这些结果强调了材料成分和表面结构在优化抗真菌表面设计中的重要性。精确的表面修饰可以显着增强抗真菌活性，但在真菌恢复力和对铜基抗菌表面的适应性方面仍然存在很大的知识差距。此外USP-DLIP结构在实际应用中的长期耐久性需要进一步研究，尤其是在材料老化和暴露于实际污染物（如汗液、唾液和有机残留物）的情况下。本研究为开发新型铜基抗真菌材料提供了重要见解，并评估了铜和铜合金表面的抗真菌潜力。这些发现对于设计和优化抗真菌表面具有重要意义，尤其是在医疗、工业和空间探索等领域。
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