瑞香狼毒叶（断肠草）对金黄色葡萄球菌和石膏样毛癣菌生长曲线的影响——材料与方法
目的研究瑞香狼毒叶提取物对常见皮肤表面菌的抑菌活性。方法采用药敏纸片法和二倍稀释法测定瑞香狼毒叶提取物对石膏样毛癣菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用。结果瑞香狼毒叶95%乙醇提取物浓度为100 mg·mL-1时对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径达12.8 mm，对石膏样毛癣菌抑菌圈直径达12.0 mm，二氯甲烷萃取物对金黄色葡萄球菌最低抑制浓度(MIC)为0.25mg·mL-1，对石膏样毛癣菌MIC为0.50mg·mL-1。结论瑞香狼毒叶提取物对石膏样毛癣菌和金黄色葡萄球菌均有抑制活性，其中对金黄色葡萄球菌抑制活性较强。
狼毒是一种不常用的中药，其味苦辛、性平、有毒，瑞香狼毒是狼毒的正名，为瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒的干燥根，又名断肠草。历代本草中狼毒是以瑞香科植物瑞香狼毒根收载入药，具有清热解毒、消肿、泻炎症、止溃疡、祛腐生肌功能。瑞香狼毒根提取物可以治疗实体瘤、肺结核和牛皮癣，据最新报道还有抗病毒的作用，尤其是抗人免疫缺陷病毒的作用。而瑞香狼毒地上部分茎和叶的化学成分以及生物活性还少见研究。人体皮肤表面菌主要由金黄色葡萄球菌和真菌石膏样毛癣菌为代表，笔者以上述两种人体皮肤表面菌为研究对象，对瑞香狼毒叶提取物进行抑菌活性研究，发现瑞香狼毒叶可抑制人皮肤表面菌，报道如下。
1材料与方法
1.1药材
瑞香狼毒叶采自四川甘孜州的天然草场，将采回的瑞香狼毒叶阴干、粉碎备用(四川大学生命科学学院侯太平教授鉴定为正品瑞香狼毒);金黄色葡萄球菌、石膏样毛癣菌(均由四川成都检验检疫局提供标准菌株)。将菌株沾取微量的菌苔接种于培养皿中培养，将培养好的典型单菌落转种于灭菌的冷却液体培养基中，利用摇床37℃培养成原液。用灭菌水把原菌液稀释成浓度10-1、10-2、10-3……。每个浓度取2mL与培养基30mL混匀倒3个平板，27℃培养箱中培养，选生长菌落数在30～300个稀释浓度作为实验菌液，金黄色葡萄球菌实验菌液为10-7，石膏样毛癣菌实验菌液为10-4。
1.2仪器
RE52-98旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂制造);W201B恒温水浴锅(上海申顺生物科技有限公司);SHB-3循环水多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);802型超净工作台(天津医疗净化设备厂);隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);手提式压力蒸汽消毒器(成都胜利医用设备厂);游标卡尺(上海精美量具厂);生物显微镜(上海光学仪器厂);Ws70-1型红外线快速干燥器(上海银屏仪器仪表有限公司)。
1.3瑞香狼毒样品提取
称取适量瑞香狼毒叶粉，用95%乙醇、无水乙醇回流提取，每种溶剂提取3次，合并3次提取液，利用旋转蒸发仪进行浓缩至膏状物，得到95%乙醇提取物和无水乙醇提取物。将上述抑菌活性高的95%乙醇提取物，利用石油醚、二氯甲烷、丙酮、甲醇进行依次萃取。萃取在分液漏斗中进行，萃取溶剂用量按照少量多次进行。每次萃取完毕将萃取液分离出来，再将剩下的进行第二次萃取，以此类推，将多次萃取液合并浓缩至膏状物。分别得到石油醚提取物、二氯甲烷提取物、丙酮提取物、甲醇提取物。
1.4乙醇粗提物的抑菌活性(药敏纸片法)
将溶解均匀的提取物用纯化水稀释为100，40，16，6.4 mg·m L-14个浓度，以不加药而加入样品溶解剂的培养液作为空白对照。将浓度为10-7金黄色葡萄球菌菌液接种在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，浓度为10-4石膏样毛癣菌菌液接种在沙氏平板上。将灭菌冷却好的直径为6 mm圆纸片在稀释好的提取样品中浸泡透后取出，酒精灯上微烘后，依次贴于平板的位置3个，同时贴上空白对照。将贴好纸片的培养皿轻放在37℃恒温培养箱中培养，细菌培养24 h，真菌27℃培养5 d，然后利用游标卡尺测定抑菌圈直径。每个样品浓度平行做3次取平均值。
1.5萃取物的抑菌活性
最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)的测定:将灭菌好的装有培养液试管排列在试管架上，第一管的装量6 mL、其余都为3 mL。加入药液并稀释:于第一支试管加入原药液1 g，混匀后吸取3.0 mL加入第二管中，同法依次稀释试管，最后一管弃去3.0 mL，使之成为递减系列浓度。并同时设对照组。趁热将试管放斜面，待培养液凝固后接入菌液0.1 mL，放于培养箱中培养，金黄色葡萄球菌37℃培养24 h后观察结果，石膏样毛癣菌27℃培养5 d后观察结果。从无菌生长的各管中找出最低药物浓度的试管，该管的药物浓度，即MIC。最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)测定:待测定完MIC后，用接种环挑取无菌生长的试管上的培养物移种至不含样品的斜面上，培养1～3 d后观察有无菌落生长，未见菌落生长的试管所对应的浓度即为最低杀菌浓度。
1.6二氯甲烷样品对两种菌处理后镜检
将样品制成浓度为2.5 mg·m L-1(10倍MIC)含药平板，待平板在无菌室冷却后取直径为6 mm的石膏样毛癣菌菌碟倒贴在药平板上，同时设空白对照，27℃培养5 d后400倍显微镜下观察菌丝形态变化。将样品稀释成浓度为2.5 mg·m L-1(10倍MIC)的含药培养液，取10-7金黄色葡萄球菌菌液接种于含药培养液中，同时设空白对照，37℃水浴振荡培养24 h，取菌液0.01 mL滴加在平板上，37℃培养24 h，挑取平板上的菌落在400倍显微镜下观察细菌形态变化。
1.7二氯甲烷样品对真菌和细菌的生长曲线的影响
细菌:将样品稀释成浓度为2.5 mg·mL-1(10倍MIC)的含药培养液，接种金黄色葡萄球菌后在摇床上培养，设不加药为对照。分别于2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 h取菌液，稀释为10-7，取10-7菌液0.01 mL滴加在平板上，培养计数。真菌:将样品稀释成浓度为2.5 mg·m L-1(10倍MIC)的含药平板，设不加药为对照。培养液平面上均匀放入新生长一致的三个石膏样毛癣菌的菌饼(直径6 mm)，将菌饼带菌丝的一面倒贴培养液表面，然后放入27℃的恒温培养箱培养，在第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10天定时测定平板上菌落的直径增长，用十字交叉法测每个菌落的两个直径，以其平均值代表菌落的直径。