2.4分光光度法测定迟钝爱德华氏菌JF-1对11种药物的敏感性结果

在快速药敏检测微孔板内生长对照区变红时(接种12h后),测定平行接种的酶标板内各微孔OD值，进而计算细菌存活率，结果见表2。以细菌存活率≤20%微孔内的最低药物质量浓度判定为最小抑菌质量浓度，由此得出氨苄青霉素、氟苯尼考、链霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、恩诺沙星、利福平对迟钝爱德华氏菌的最小抑菌质量浓度分别为0.4、0.8、3.2、0.4、0.4、1.6、0.4、0.8、6.4、3.2、0.05μg/mL,结果与显色法完全吻合。

2.5常规试管稀释法测定迟钝爱德华氏菌JF-1对11种药物的敏感性结果

通过观察试管稀释法测定最小抑菌质量浓度的结果显示,各试管的浊度需要在28,^{circ}C培养24,h后才能趋于稳定，结果见表3(药物质量浓度设置同图1)，以肉眼无法观察到明显浑浊试管中药物的最低质量浓度为最小抑菌质量浓度，氨苄青霉素、氟苯尼考、链霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、恩诺沙星、利福平分别为0.2、0.8、3.2、0.4、0.4、1.6、0.4、0.8、3.2、3.2、0.05μg/mL,其中氨苄青霉素和复方新诺明检测结果与显色法及分光光度法存在差异，其他药物检测结果完全吻合。

表2分光光度法测定11种药物梯度稀释浓度对迟钝爱德华氏菌JF-1存活率的影响结果%

不同 稀释度	包被药物种类
	氨苄青霉素	氟苯尼考	链霉素	阿米卡星	土霉素	新霉素	强力霉素	多粘菌素B	复方新诺明	恩诺沙星	利福平
A	9.2	8.9	10.6	9.5	11.1	9.7	10.1	9.6	12.4	11.5	9.1
B	9.4	9.2	11.1	9.7	11.2	9.8	10.4	9.8	13.3	11.6	9.1
C	9.8	9.7	11.5	10.1	11.4	10.1	10.6	10.1	14.1	13.6	9.2
D	10.1	10.5	11.6	10.3	11.7	10.3	10.6	10.4	15.7	14.1	9.2
E	12.3	33.6	13.4	11.3	12.5	10.5	10.8	10.8	26.7	64.0	9.4
F	24.2	40.2	31.9	34.5	50.9	17.4	35.9	47.2	43.1	69.6	9.4
G	56.7	42.2	67.3	52.8	77.9	38.2	65.7	51.8	51.3	71.3	9.7
H	87.8	66.8	89.2	58.8	90.5	40.1	72.6	58.5	57.9	74.9	34.8

注:“A~H”字母代表与图1示意图相对应的不同药物包被质量浓度;黑体标识为最小抑菌质量浓度对应孔.

表3试管稀释法测定11种药物梯度稀释浓度对迟钝爱德华氏菌JF-1的生长影响结果

不同稀释度	试管内溶解的药物种类
	氨苄青霉素	氟苯尼考	链霉素	阿米卡星	土霉素	新霉素	强力霉素	多粘菌素B	复方新诺明	恩诺沙星	利福平
A	-	-	-	-	-	-		-	-	-	一
B	-	-	-	-		-	-	-	-	-	-
C	-	-		-	-	-	-	-	-	-	一
D		-	-	-	-	一	-	-	-	-	一
E	-	+	-	-	-	-	-	-	-	十	-
F	-	+	+	+	+	-	+	+	+	+	-
G	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-
H	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+

注:“一”代表试管观察结果为澄清;“+”代表试管观察结果为浑浊;“A~H”字母代表与图1示意图相对应的不同药物包被质量浓度.

3讨论

3.1方法与显色指示剂选用

目前，药敏检测常规方法主要采用K-B纸片法与肉汤稀释法，但K-B纸片法存在操作繁琐、工作量较大、稳定性和准确性较低等问题，无法获得药物的最小抑菌浓度。普通的肉汤稀释法需要专业的仪器设备辅助，且对结果判读不够直观。这两种方法均不适合在养殖生产中应用推广。为解决这个问题，本研究以阿尔玛蓝染料作为细菌生长指示剂，在对检测系统各项参数优选的基础上，通过观测药敏检测微孔板内测试孔的颜色差异变化，实现对药物最小抑菌质量浓度的直观判定，检测结果与分光光度法及试管稀释法基本保持一致,说明本研究的快速药敏检测方法切实可行。

本研究基于氧化/还原反应原理，当细菌生长增殖时，由于细菌细胞内生化反应产生的还原力可将阿尔玛蓝染料发生还原，从而使其颜色由氧化态下的蓝色转变为还原态下的粉红色，这一颜色变化可利用肉眼进行直接判断。由于阿尔玛蓝染料对细胞无毒害作用，不影响细菌生长，因此可直接将其预先添加在药敏检测板微孔内，从而使得检测操作更加简便，而且可连续监测细菌的增殖动态，使药敏检测更为简便和快捷。

3.2药敏检测接种密度

药敏检测接种密度的选择对于快速药敏检测结果的准确性和实用性十分重要，由于如果接菌密度过高，细菌即使受到药物作用增殖受到抑制，如

第1期刁菁等:一种水产迟钝爱德华氏菌快速药敏检测方法的研究27

果接种菌体未能在短时间内被杀死，其本底细菌在经过一段时间的生命化学活动后而产生还原力也能使的阿尔玛蓝指示剂发生颜色变化，从而使检测结果失真;如果接菌密度过低又将会大大延长药敏检测的时间跨度，使快速药敏检测失去意义。本研究在经过初筛选定1x105个/mL和1x106个/mL两个菌液密度，通过进一步药物检测试验结果显示，1x106个/mL菌液在接种8h后分光光度法和显色法检测结果仍存在微小偏差，而1x105个/mL接种密度能很好地保证结果可靠，因此本研究的快速药敏检测体系以1x10个/mL作为接种密度。

3.3不同药敏检测方法结果比较

本研究通过运用分光光度法及试管稀释法两种传统药敏检测方法与基于颜色判定的快速药敏检测进行了对比，结果显示分光光度法检测结果与显色法完全一致，而试管稀释法却存在一定偏差，其对氨苄青霉素和复方新诺明检测的最小抑菌质量浓度分别为0.2μg/mL和3.2μg/mL,比显色法测定的最小抑菌质量浓度低一个梯度，推测其原因可能是由于培养条件差异引起的。由于溶氧效率是限制静止培养条件下好氧菌生长的重要影响因素，一般情况下体积越小比面积越大，在高比面积的培养模式下外界向培养基内溶解氧气的效率越高，细菌生长条件越优越，有利于快速增殖，这时同等药物浓度有可能会对生长条件较差菌群形成更好的抑制效果，因此试管稀释法出现了两种药物最小抑菌浓度低于微孔显色法，这也是为什么试管稀释法需要培养24h之后浊度才能趋于稳定的原因。另外，需要指出的是本研究建立快速药敏检测方法体系，包括菌体接种浓度、不同药物浓度梯度设置以及结果判定时间范围可能仅针对迟钝爱德华氏菌适用，当用于其他菌种快速药敏检测时会出现一定的偏差(该结果未在本论文中列出)，这可能跟不同菌种的生理代谢特点存在联系，因此，如果将本方法用于其他菌种的药敏检测时，仍需对本方法体系具体参数进行调整和修正。

本研究通过开展迟钝爱德华氏菌快速药敏检测方法研究，构建了该菌的快速药敏检测试剂盒的雏形，也将为今后开发简便、快捷、敏感、高效的水产病原细菌药敏检测产品提供基础资料和参考。

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