25种天然植物精油对蓝莓致病菌生长曲线、抑制作用（二）
1材料与方法
1.1材料与试剂
蓝莓果实为脆甜花香25号，采自云南省玉溪市，蓝莓冷链运输至实验室后筛选出大小、硬度均一，表面无机械擦伤，无病虫害的果实置于4℃备用。
丁香罗勒油、芫荽精油、山苍子精油、杉木精油、薰衣草精油、快乐鼠尾草精油、广藿香精油、松针精油、没药精油、当归精油、牡荆精油、岩兰草精油、茉莉花精油、茶树精油、依兰精油、红景天精油、甜罗勒精油、花椒精油、艾草精油、芥末精油江西万花香料有限公司；透骨草精油媚生堂芳疗精油商城；细辛精油江西健民天然香料油厂；吐温80上海麦克林生化科技股份有限公司。
1.2仪器与设备
微生物生长曲线监测系统，丹麦Biosense公司；Universal Hood II凝胶成像仪美国Bio-Rad公司；TGreat型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪天根生化科技（北京）有限公司；SCW-CJ-1F垂直流洁净工作台苏州安瑞净化科技有限公司。
1.3方法
1.3.1蓝莓致病菌的收集以及菌种纯化
将采购的盒装蓝莓果实放置于温度25℃、相对湿度95%的培养箱中培养至病害发生。沿用传统的组织切割法，将不同发病症状的果实分开放置，取发病部位组织（病健交界处，长×宽＝3 mm×3 mm）于无菌水中清洗，之后置于体积分数为75%的乙醇溶液中浸泡30 s，取出后用无菌水清洗3遍，将组织贴于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基培养，每种形态接种3个培养皿，在28℃、相对湿度95%条件下培养3～5 d，每天观察平板，及时将新长的菌（边缘处挑取少量菌丝）转接到新的PDA培养基直至其菌落形态一致、无杂菌，即获得纯化的致病菌。蓝莓致病菌在不同时间点共分离3次。对纯化的致病菌进行编号，挑取少许菌种到2 mL无菌离心管中-80℃保存。
1.3.2病原菌菌落形态学观察鉴定
将纯化后的菌株接种至PDA培养基中，在28℃、相对湿度95%条件下培养5 d，利用光学显微镜观察其菌丝和孢子的形态，结合真菌鉴定手册进行初级鉴定。
1.3.3病原菌致病性测定
选取健康无伤、大小均一的蓝莓果实，用体积分数2%的次氯酸钠溶液清洗晾干后，在蓝莓赤道部位划3 mm×3 mm的伤口，将10μL 1×106 CFU/mL的孢子悬浮液注入每颗蓝莓伤口，晾干后于25℃、相对湿度95%的培养箱中培养，并持续观察其发病情况。每种菌接种10颗蓝莓，重复3次，根据科赫法则（接种后的发病症状是否与分离前一致，病斑扩散情况以及发病率）判定该菌株是否为蓝莓采后致病菌。以未接种病原菌的蓝莓为对照组。
1.3.4菌落分子生物学鉴定及系统发育树构建
刮取适量孢子至马铃薯葡萄糖肉汤（potato dextrose broth，PDB）培养液中，在28℃、180 r/min摇床培养2 d，过滤菌丝，用0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）冲洗3次后，利用十六烷基三甲基溴化铵法提取各纯化菌株的DNA，用3种真菌通用引物ITS（600 bp，ITS1/ITS4）、BenA（511 bp，Bt2a/Bt2b）和CaM（580 bp，CMD5/CMD6）分别对病原菌的基因组进行PCR扩增。将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果与NCBI数据库上已知序列进行BLAST同源比对，选取同源性较高的基因进行DNAMAN序列比对，再采用MEGA 11.0软件通过Neighbor-Joining方法构建系统发育树。
1.3.5病原菌最适温度测定
将病原菌菌饼接入PDA培养基，分别放入4、15、20、25、28、30、35℃培养箱进行为期3 d的培养，结束后测量其菌斑直径。每个温度梯度做3次重复。
1.3.6病原菌生长曲线测定
将一定量的孢子悬浮液（病原菌I和病原菌II）加入适量PDB培养液中，使其终浓度为1×105 CFU/mL，在摇床中培养72 h，每隔6 h取样烘干至质量恒定后进行测量，每组重复3次。由于病原菌III产孢量少，根据李鹏等的方法，取PDA培养基中培养5 d的病原菌III，用6 mm的打孔器在菌斑最外围打菌饼并将其添加到PDB培养液中培养72 h，每隔6 h取样烘干至质量恒定后进行测量，每组3次重复。
1.3.7病原菌孢子萌发率测定
将病原菌分生孢子菌悬液注入到PDB中，确保其终浓度为1×106 CFU/mL（病原菌I和病原菌II）或1×105 CFU/mL（病原菌III），放入摇床中培养，分别在0、3、6、9、12、15、18、21、24 h时取出，参考李翀的孢子萌发率测定方法并稍作修改。病原菌I、II每组计数100个孢子，病原菌III每组计数50个孢子，以牙管长度超过其孢子半径判断为萌发，统计孢子萌发的情况，每种菌进行3次生物学重复。按式（1）计算孢子萌发率：
孢子萌发率=孢子萌发数/孢子总数*100%
1.3.8 96孔板法初筛抑菌精油
参考孙畅等的96孔板抑菌法并稍作修改。参考各种精油的抑菌浓度以及前期预实验，以100μL PDB为底液，加入等体积1×106 CFU/mL的病原菌孢子悬浮液，再加入适量精油使其浓度分别为0、1.00、1.25、1.50、2.00μL/mL，每组设3个重复，空白对照为加入无菌的PDB培养基，阴性对照分别为加入孢子悬浮液的PDB培养基和加入孢子悬液、吐温80的PDB培养基。25℃培养2 d，在显微镜下观察菌的生长情况，统计致病菌在不同浓度精油培养基的生长情况（有无菌丝生长）。
1.3.9培养皿法筛选精油有效抑菌浓度
根据96孔板法初筛的精油浓度，再结合二倍稀释法细筛其最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimal fungicidal concentration，MFC）。将适量精油加入至含有0.50%（V/V）吐温80的无菌PDA培养基中，确保终浓度分别为0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00μL/mL，倒入培养皿（直径90 mm，容积110 mL），等待冷却凝固。取新培养的菌饼（6 mm）接种至PDA培养基上，每个浓度做3～4个重复，放入适宜的培养箱（病原菌I、III、IV：25℃；病原菌II：28℃）中培养4 d左右，期间采用十字交叉法测量菌斑直径并按式（2）计算抑菌率。48 h内使菌饼无生长变化的精油浓度为MIC，96 h内使菌饼无生长变化的精油浓度为MFC。
式中：de为实验组病斑直径/mm；dc为对照组病斑直径/mm。
1.3.10 5种植物精油的抑菌作用测定
根据1.3.3节的方法清理蓝莓果实并进行致病菌接种，将蓝莓果实随机分成6组，每组30颗蓝莓，接种10μL皮落青霉孢子悬浮液（1×106 CFU/mL），每组重复3次。将滴加精油的脱脂棉粘在盛放蓝莓的透明塑料盒（盒内总体积320 mL）的盒盖上（浓度为1 MFC），于温度为25℃、相对湿度为95%的培养箱中培养6 d，观察并记录果实发病情况。
1.4数据统计与分析
蓝莓、孢子和菌丝样本的分配遵循完全随机的原则。每个实验重复3次后，使用SPSS 16.0软件进行统计分析，图表使用Origin 2021软件绘制。数据结果以表示。P＜0.05具有统计学意义。
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