一株潜在益生菌：约氏乳杆菌G1的体外生物学特性评价
1.2.4 菌株生长曲线测定
使用丹麦Biosense公司oCelloScope微生物生长曲线分析系统进行测定。挑取单个菌落接种于5 mL MRS肉汤培养基，37℃培养24 h。将菌液用新鲜MRS肉汤培养基稀释至OD600 nm约为0.1，以每孔200 μL的体积接种于无菌96孔细胞培养板中。将孔板置于oCelloScope系统样品台，设置培养温度为37℃，采用明场成像模式，每30分钟对每个样品孔自动进行一次全视野扫描成像，连续监测24 h。系统软件（oCelloScope App Suite）实时分析图像，通过量化生物量浓度自动生成生长曲线。每个菌株设置3个重复。
1.2.5 菌株产酸能力测定
挑取单个菌落接种 5 mL MRS肉汤培养基，37℃ 培养 24h，以 1%的接种量接种 MRS肉汤培养基，采用 pH计每隔 2 h测定 pH值，共测定 24 h，每个菌株设置 3个重复，取均值绘制产酸曲线。
1.2.6 菌株耐酸耐胆盐测定
参照Manzoor等方法挑取单个菌落接种 5 mL MRS肉汤培养基，培养至对数生长期后，取一定量菌液离心洗涤，并用无菌PBS重悬制备成高浓度菌悬液。将该菌悬液分别接种预先调定为 pH 2.0、pH 3.0和 pH 4.0的 MRS培养基以及含有 0.3% 和 0.5% 胆盐的 MRS培养基中，并以普通 MRS培养基作为对照。将所有处理组置于 37℃ 恒温培养，并分别于 0、1、2、3、4 h取样。通过系列稀释与平板涂布法对活菌进行计数，并以 0h的活菌数为基准，计算各时间点的存活率，每个菌株设置 3个重复，按照以下公式计算存活率：
存活率 = (At / A0) × 100%
式(1)中：A0 为 0h的初始活菌数，At 为处理 t小时后的活菌数。
1.2.7 菌株自聚集能力测定
参照 Ruiz-Moyano等方法挑取单个菌落接种 5 mL MRS肉汤培养基，37℃ 恒温摇床培养 24 h，5000 r/min 离心 10 min 后弃去上清，用PBS洗涤两次后重悬，调节菌悬液 OD600 nm 处的吸光度为0.5～0.6，室温静置 4h后，测定菌悬液 OD600 nm 处的吸光度。每个菌株设置 3个重复，按照以下公式计算自聚集率：
自聚集率 = (1 - A1 / A0) × 100%
式(2)中：A0为0h的吸光度值，A1为静置4h的吸光度值。
1.2.8 菌株表面疏水力测定
参照 Crow等方法挑取单个菌落接种 5 mL MRS肉汤培养基，37℃ 恒温摇床培养 24 h，5000 r/min 离心 10 min 后弃去上清，用 PBS洗涤两次后重悬，调节菌悬液 OD600 nm 处的吸光度为0.5~0.6，将菌悬液与氯仿按照 3:1的比例混合，涡旋振荡 3 min，室温静置 30 min，吸取上层水相，测定 OD600 nm 处的吸光度。每个菌株设置 3个重复，按照以下公式计算疏水率：
疏水率 = (1 - A1 / A0) × 100%
式(3)中：A0 为 0h的吸光度值，A1 为静置 30 min 后的吸光度值。
1.2.9 菌株上清液抑菌能力测定
参照李平等方法制备无细胞上清液。挑取单个菌落接种 5 mL MRS肉汤培养基，37℃ 恒温摇床培养 24 h，得到细菌发酵液，8000 r/min 离心15 min，收集上清液置于 -80℃ 冷冻 24 h，将冷冻后的菌液转移到真空冷冻干燥机中，冻干 24 h，称取适量冻干产物，用双蒸水溶解后，进行梯度稀释，分别得到 125、250和 500mg/mL的溶液，最后用 0.22μm 的滤膜过滤冻干粉稀释液，得到无细胞上清液，-20℃ 保存备用。使用双层琼脂牛津杯法测定菌株抑菌能力。选择大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、沙门氏菌(ATCC 14028)为质控菌株，将质控菌接种到 LB肉汤培养基中，37℃ 恒温摇床培养 16 h备用。在培养皿底部倒入 10 mL 水琼脂，待琼脂冷却后放置牛津杯，待培养基凝固后，取出牛津杯，吸取 200μL质控菌液均匀涂布于平板表面，在孔中加入 200μL不同浓度的无细胞上清液，37℃ 培养 24 h，测定其抑菌圈大小，每株菌设置 3个重复，采用无菌 MRS肉汤培养基作为对照。
1.2.10 菌株溶血性能测定
挑取单个菌落接种 5 mL MRS肉汤培养基，37℃ 恒温摇床培养 24 h，用接种环取菌液在绵羊血平板画线，37℃ 培养 24 h 观察是否产生溶血圈。
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