鹌鹑肺炎克雷伯菌血清型鉴定、耐药性检测及致病潜力（一）
摘要：【目的】从腹泻鹌鹑粪便样本中分离并鉴定肺炎克雷伯菌，以期为鹌鹑肺炎克雷伯菌疾病防控提供基础。【方法】从8份腹泻鹌鹑粪便样本中筛选纯化菌落，通过平板划线法对细菌进行分离纯化培养，利用PCR扩增16SrDNA序列并测序，使用Mega11.0软件构建系统进化树。采用K-B法检测菌株对常见抗菌药物的敏感性，并检测菌株中耐药基因和毒力基因分布情况，探究其生物学特性，通过动物试验评估菌株的致病性。【结果】本研究从腹泻鹌鹑粪便样本中分离并鉴定出2株肺炎克雷伯菌，分别命名为Ksp-A1和Ksp-A2,均属于K57血清型。系统进化树结果显示，2株分离株与其他已知肺炎克雷伯菌株相似性较高，且与肺炎克雷伯菌DB-4和WGT-31株属于同一进化分支。药敏试验结果显示，分离株对氨苄西林、苯唑西林和红霉素等表现耐药。分离株Ksp-A1和Ksp-A2均携带多种耐药基因，包括blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat1基因。2株分离株均携带毒力基因K88、hlyE、iucD、irp2、ompA和ompC.生物学特性分析显示，在pH7.0的LB肉汤培养基中，分离株Ksp-A1和Ksp-A2均在2h内进入对数生长期，并分别在12和9h达到峰值。小鼠致病性试验结果显示，注射菌液后，小鼠表现被毛粗乱、精神沉郁、呼吸急促及腹泻等感染症状，且随着菌液浓度增加，小鼠死亡率逐渐上升，菌液浓度为1×109CFU/mL时，小鼠死亡率均达100%,Ksp-A1和Ksp-A2对小鼠的半数致死剂量（LD50）分别为3.3×107和2.6×106CFU.【结论】试验成功分离获得2株鹌鹑源K57型肺炎克雷伯菌，其对β-内酰胺类药物表现耐药，生长速度较快，对酸碱耐受能力强。研究结果为鹌鹑源肺炎克雷伯菌疾病的防治提供了基础数据。
肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）克雷伯菌属（Klebsiella），是一种革兰阴性菌，常见于动物黏膜或自然环境中。肺炎克雷伯菌具有多种质粒和可移动遗传原件，这些遗传原件使其携带多种抗性基因或者从环境中获取新的抗性基因，再将这些耐药基因传给敏感菌株，从而造成超级耐药菌株的出现，导致疾病的发生。
2020年中国细菌耐药监测报告指出，医源肺炎克雷伯菌在医源革兰阴性菌中的分离率排第二，仅次于大肠杆菌，耐药性呈明显上升趋势。肺炎克雷伯菌的毒力因子和血清型的研究对于理解其致病机制、制定有效的防控策略具有重要意义。其毒力因子包括荚膜（capsule）、菌毛（fimbriae）、外膜蛋白（outermembraneproteins）等，它们共同作用，增强了细菌对宿主的侵袭力和抵抗宿主免疫反应的能力。
血清型研究有助于识别不同肺炎克雷伯菌株的流行病学特征，为疫情监测和控制提供科学依据。鹌鹑作为一种常见的禽类，其饲养过程中的健康管理对于控制和预防耐药菌的传播具有重要意义。然而，目前关于肺炎克雷伯菌在鹌鹑中的流行情况、耐药性和毒力基因的相关报道较少。有研究表明，不同宿主来源的肺炎克雷伯菌在耐药性和分子特点上存在差异，这可能影响其在人与动物间的传播。近年来，随着养禽业的快速发展，鹌鹑等禽类的细菌感染率及耐药性呈明显上升趋势，对禽类疾病防控构成了严峻挑战。然而，目前关于鹌鹑源病原菌的耐药性及毒力基因分布的研究较为匮乏。本研究拟从腹泻鹌鹑粪便样本中分离并鉴定病原菌，通过对分离菌株的基因型和血清型鉴定、耐药性检测、毒力基因筛查等生物学分析，评估其耐药机制与致病潜力，以期为相关疾病防控、疫苗开发及抗菌药合理使用提供参考。
1材料与方法
1.1样品来源及试验
动物8份12周龄鹌鹑腹泻粪便样品采集于新疆阿克苏地区某养禽场；120只6周龄、25-30gCL级昆明小鼠（雌雄各半）购自塔里木大学动物科学与技术学院合作实验动物中心。
本研究所有动物试验严格遵循相关动物伦理法规，所有操作符合塔里木大学实验动物中心动物福利要求。
1.2主要试剂及仪器
LB琼脂培养基、LB肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、均购自杭州微生物试剂有限公司；革兰染色试剂盒购自北京酷来搏科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；2×EasyTaqPCRSuperMix（+Dye）购自北京全式金生物技术股份有限公司。
梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪均购自Bio-Rad公司；oCelloScope微生物快速药敏监测系统购自丹麦BioSense公司；隔水式恒温培养箱购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3病原菌的分离培养及生长特性鉴定
使用灭菌接种环分别将8份腹泻鹌鹑粪便样品划线接种于LB琼脂培养基，37℃恒温培养箱倒置培养12h.挑取疑似菌落接种于LB肉汤培养基，再划线接种于LB琼脂培养基，将纯培养单菌落分别划线接种于麦康凯琼脂、SS琼脂和LB琼脂平板，观察细菌生长状态，使用革兰染色试剂盒对细菌进行染色，于显微镜下观察菌体形态特征。纯培养菌株使用50%甘油细胞冻存管于―80℃保种备用。
1.4分离菌株的生化鉴定
将分离的纯培养菌株接种到LB肉汤培养基，37℃、180r/min过夜震荡培养，对纯培养细菌进行生化鉴定。将预培养的菌液接种到各生化鉴定试剂管中，每个测试项目接种5-10μL菌液，并设置无菌水作为空白对照。将接种后的生化鉴定试剂板放置于37℃恒温培养箱中培养24h.观察并记录每个孔中的生化反应结果，将生化反应评估结果与肺炎克雷伯菌的标准生化特性进行对比，确定菌株的生化特征。