水貂肠道乳酸杆菌RSJ生长曲线及产酸、药敏试验结果（一）
近年来，水貂等小型毛皮动物消化道菌群的研究已成为一个重要的新课题。但目前国内对动物消化道菌群的研究报道较少，尤其是对水貂肠道菌群的研究未见报道。其中，乳酸菌作为动物肠道中的优势菌群之一，其对动物的有益作用已被许多研究结果所证实。乳酸杆菌是仔猪肠道正常微生物区系中的优势菌群，可利用糖类发酵产生大量乳酸、乙酸及其他挥发性脂肪酸，对维持仔猪肠道微生物区系平衡和消化机能起着重要作用。市售乳酸杆菌菌株大部分是从人和哺乳动物肠道中或土壤中分离得到的。寄主的遗传特性和环境影响肠道菌群结构和组成，寄主和肠道菌之间存在着相互选择、相互依赖的关系，因而一种适于某类动物的微生态制剂不一定适于另一类动物。要保持定植能力，活菌制剂的生产菌种应从同种属宿主分离。鉴于此,本研究拟从健康水貂肠道中分离筛选出耐酸、抑菌效果好、安全等特点的菌株，为开发应用于防治水貂腹泻性疾病的微生态制剂提供参考依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料
健康成年丹麦红眼母貂1只，来自青岛某水貂养殖场。
1.1.2主要试剂
营养琼脂培养基、营养肉汤培养基购自北京奥博星生物技术公司，莫匹罗星锂盐改良MRS培养基购于青岛高科园海博生物技术有限公司、糖醇发酵管(葡、麦、蔗、乳、甘、木、果、山、七叶苷等)、药敏纸片购杭州天和微生物试剂有限公司。
1.1.3 DNA提取和16S rRNA基因扩增所用试剂
PBS缓冲液，TE缓冲液，细菌裂解液，Premixed Taq(incl dye)、DL 2 000 DNA Marker购自北京托普赛生物有限公司，电泳级琼脂糖Agarose Regular购自TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2方法
1.2.1样品的采集与处理
分别取各段肠粘膜和粪便样品1 g，分别置于含生理盐水9 mL三角瓶，振荡混匀30 min，制成匀浆后，静置15 min，制成10-1的稀释液。
1.2.2分离纯化
取样品的稀释液100μL涂布于含有碳酸钙的MRS培养基上，厌氧37℃培养24 h。挑取有溶钙圈的菌落，进行革兰氏染色镜检。疑似阳性的菌落接种到莫匹罗星锂盐改良MRS培养基中纯化培养。
1.2.3生化试验
鉴定按常规方法对分离的菌株进行过氧化氢酶试验，氧化酶试验、KOH试验，吲哚试验、硫化氢试验、糖醇发酵试验、MR试验、VP试验、尿素酶试验、西蒙氏枸橼酸盐试验、明胶液化试验及运动力试验等。
1.2.4 16S rRNA基因片段的序列分析将分离的菌株接种于5 mL营养肉汤中培养，取4.5 mL菌液12 000 r/min离心2 min，参考文献的方法提取DNA。
参考相关文献，由上海生工生物工程有限公司合成了一对为乳酸杆菌属特异性引物(Lac16S正向371 5'-GCAGTAGGGAATCTTCCACA-3'，Lac16S反向593 5'-GCTTTA CGCCCAATAAATC-3'，扩增片断长度为223 bp)。
PCR反应体系：Premixed Taq 25μL，正反向引物各加1μL，DNA模板2μL，补ddH2O至体积为50μL。PCR扩增程序为：94℃5 min预变性；94℃30 s变性，56℃30 s退火，72℃30 s延伸，循环35次；72℃5 min延伸。取5μL PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)电泳后在凝胶成像仪中观察扩增结果。
PCR产物经试剂盒纯化后，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。采用BLAST与GenBank数据库中已收录的乳酸杆菌属16S rRNA的序列比对，并使用MegAlian中的Clustal X Method进行同源性比较。
1.2.5耐酸试验
调节营养肉汤pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，分别装入试管中，每管5 mL。将菌株液体培养物10μL接入，37℃培养24 h，观察菌株生长情况。
1.2.6生长曲线及产酸试验
将筛选出的乳酸菌接种于盛有MRS液体培养基(接种量为1∶50)的三角瓶中，37℃，200 r/min培养48 h。其中每隔2 h取样于紫外分光光度计测定菌液的OD值(600 nm)和pH，并绘制曲线。用未接种的培养基作空白对照。
1.2.7药敏试验
采用纸片扩散试验法。将乳酸菌悬液稀释至108 cfu/mL后取100 uL涂布于MRS培养基上，用灭菌的镊子将药敏片贴到培养基表面，轻轻压实。将培养基置于37℃培养24 h，测定药敏圈直径。
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