浒苔多糖降解微生物采集、分离、筛选、鉴定及生长曲线测定（一）
摘要：浒苔中含有大量的浒苔多糖，分解、利用及转化浒苔多糖对藻类资源利用以及海洋碳循环具有重要意义。为筛选出能降解浒苔多糖的微生物，提高浒苔生物量的回收利用效率，本研究利用微生物分离鉴定以及基质测试技术从浒苔绿潮中分离鉴定了浮游及浒苔附着微生物，成功地从分离到的菌株中筛选出能降解浒苔多糖的菌株，并选取黄杆菌Algibacter lectus S7和交替單胞菌Alteromonas confluentis A1-6作为代表菌株进行碳源利用谱分析。结果发现：黄杆菌Algibacter lectus S7可以分解利用浒苔多糖、木聚糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖；交替单胞菌Alteromonas confluentis A1-6可以分解利用浒苔多糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、木聚糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖和糊精。从生长曲线可见，两菌株均能高效分解利用浒苔多糖，并分别揭示了两菌株对碳源利用情况，为海洋微生物对浒苔多糖的分解代谢研究及工业上提高浒苔生物量回收利用效率提供菌种资源及碳源参考。
浒苔（Ulva prolifera，Enteromorpha prolifera），隶属于绿藻门石莼科浒苔属，俗称“海青菜”“绿紫菜”，是生活在近海滩涂中的天然野生绿藻，也是我国东南沿海最常见的海洋绿藻之一。自2007年起，每年夏季我国黄海都会爆发由浒苔引发的大规模绿潮。其中，2008年青岛暴发的浒苔绿潮是世界上最大的绿潮，影响海域超过2万km2，实际覆盖面积超过400 km2。大量漂浮浒苔遮蔽阳光，消耗水中氧气，造成海洋生物死亡，对养殖业及海洋环境带来极大的危害。为减少浒苔绿潮对海洋环境的污染，政府每年都要花费巨额资金，出动大量人力来打捞浒苔，同时面临着提高浒苔生物量资源的回收利用效率问题。
浒苔多糖是浒苔生物量的主要成分，占浒苔干重的20%～70%。浒苔多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂等多种生理活性功能。而低分子量的浒苔寡糖具有更好的生物活性及水溶性，更广泛地应用于药物及功能性食物中。同时，浒苔可作为生产生物柴油及生物乙醇的材料。目前对浒苔生物量的资源利用还存在成本高、转化效率低的问题。因此，筛选出能高效降解浒苔多糖的微生物及酶类，加快多糖物质的降解，是提高浒苔生物质利用效率及实现资源转化的关键，也是浒苔绿潮污染治理中重要的一环。
浒苔多糖主要成分为葡萄糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸等，并且含有以糖醛酸和硫酸基为主要结构的水溶性多糖，其中糖醛酸和硫酸根的含量相对比较稳定。目前对浒苔多糖降解微生物的研究还十分匮乏。Li等从腐烂浒苔绿藻表面底泥中分离到一株γ-变形菌门的交替单胞菌（Alteromonas sp.A321），发现它能产生某种可分解浒苔多糖的酶。此外，黄杆菌在浒苔绿潮爆发时期大量出现。Liu等分析并比较了胶州湾浒苔绿潮爆发区域中不同时期浒苔附着微生物及海水中微生物的结构组成，发现浒苔绿潮中期的海水中黄杆菌的丰度最高，达45%。另据Lin等研究发现，爆发浒苔的养殖水体中黄杆菌丰度是没有爆发浒苔的水体中的3～5倍。黄杆菌的大量出现可能是由于黄杆菌能首先分解利用浒苔多糖，因而在与其他微生物竞争碳源时占据优势，得以大量生长繁殖。
本研究对浒苔绿潮期间的微生物进行了分离及鉴定，筛选出了能降解浒苔多糖的微生物，并选取2株代表菌进行了多糖底物利用谱分析。以期能筛选出高效降解浒苔多糖的微生物，并解析其多糖底物利用谱，为由浒苔引起的海洋污染的治理问题提供理论基础和菌种资源；为工业上提高浒苔生物量回收利用效率提供新思路。
1材料与方法
1.1浒苔及微生物样品的采集及分离鉴定
在广西北海金海湾红树林海域和山东青岛栈桥及金沙滩海域的浒苔绿潮爆发地用无菌自封袋和采样瓶分别采集浒苔及海水样品。分别分离浒苔附着微生物和海水中的浮游微生物。
浒苔附着微生物的分离方法：取50 g新鲜浒苔用500 mL无菌海水清洗3遍后沥干，装入1 000 mL无菌锥形瓶中，加入500 mL无菌海水，置于超声清洗机中超声水浴（35 kHz）并用振荡的方法分离，收集液体。
分别取海水及浒苔附着菌液，梯度稀释后均匀涂布于2216E固体海洋培养基平板上，倒置放入28℃恒温培养箱培养24～36 h，观察菌落生长情况。挑取单菌落，接种于2216E液体培养基中，放入28℃恒温摇床培养24 h。用16S rRNA通用引物对27F/1492R PCR扩增后送测序公司测序，通过比对NCBI数据库，鉴定微生物的种类，并将分离鉴定后的菌株用20%甘油保存于-80℃冰箱中。
选取重点分析的5个菌株，分别根据NCBI中序列的比对结果，选取相似度高的几株菌的序列构建系统发育树，在Mega X中用Clustal W对序列进行比对后用邻接法（neighbor joining）构建系统发育树。
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