抗生素PK/PD建模新策略：利用MIC值预测耐药突变体的体外杀灭动力学
目的：基于体外时间-杀灭实验数据可开发计算机药代动力学/药效学（PK/PD）模型，为抗生素给药方案提供有价值的信息。本研究旨在开发一种基于机制的计算机模型，能够描述大肠杆菌MG1655野生型及六个同基因突变体暴露于环丙沙星后的体外时间-杀灭实验，并寻找可用于简化未来类似研究特征分析的关系。
方法：本研究建立了一种基于机制的PK/PD模型，用于描述大肠杆菌暴露于环丙沙星后的杀灭动力学。野生型及六个特征明确的突变体（每个携带一至四个临床相关耐药突变）暴露于大范围的静态环丙沙星浓度。
结果：所建立的模型包括易感性生长细菌、低易感性（预先存在耐药性）生长细菌、非易感性非生长细菌以及非菌落形成非生长细菌。非菌落形成状态可能由丝状体形成所致，是描述接近MIC浓度数据所必需的。采用具有共同模型结构、不同菌株杀灭效力（EC50）的模型，成功表征了野生型及六个大肠杆菌突变体的时间-杀灭曲线。
结论：模型推导的突变体特异性EC50估计值与实验测定的MIC值高度相关（r²=0.99），这意味着基于该模型，突变体菌株的体外时间-杀灭特征可通过MIC值单独进行合理预测。
引言
由于抗生素的过度使用和误用，抗生素耐药性问题日益严重，正威胁着将我们带回"前抗生素时代"。为对抗现有耐药并限制治疗期间耐药细菌的富集，必须理解常见耐药突变与暴露于抗生素后细菌生长和死亡时间进程之间的关系。基于体外时间-杀灭实验的PK/PD计算机模型可提供预测抗生素最佳给药策略的相关信息。通过此类模型预测不同剂量和给药间隔下的细菌杀灭情况，可指导药物开发中候选药物的选择，并优化现有给药方案，不仅提高疗效，还可限制耐药性的发展。过去十年，监管机构一直推荐基于模型的药物开发，以强化关键决策的科学依据，PK/PD模型也因此受到制药行业的日益关注。旨在基于有限数量的未来实验做出合理预测的框架，对提高药物开发效率具有重要价值。已针对不同细菌菌株和抗生素开发了多种计算机PK/PD模型。然而，这些模型的目的可能有所不同。例如，一些模型侧重于基于数据评估机制理论，另一些模型则更侧重于提高药物开发效率，例如基于有限的新信息预测未研究的结果，或在存在低易感性细菌的情况下预测不同给药方案。通过基于机制的PK/PD模型，我们可在耐药突变体存在的情况下探索不同给药方案，以研究如何减少或克服耐药选择。为使模型适用于药物开发，期望模型结构具有通用性。
此前已开发了一种基于机制的计算机模型，描述了化脓性链球菌暴露于不同类别抗生素的体外时间-杀灭特征。该模型拟合了静态和动态时间-杀灭实验的数据，并预测了体内确定的PK/PD指数类别和大小。此外，已证明该模型提供了有用的基础结构，可通过描述适应性耐药的结构性元素进行扩展。
本研究将该模型进一步扩展，用于研究大肠杆菌暴露于氟喹诺酮类抗生素的情况。氟喹诺酮类是治疗革兰阴性菌感染的重要抗生素类别。然而，过去十年全球范围内氟喹诺酮类耐药性呈上升趋势。环丙沙星是一种氟喹诺酮类抗生素，通过抑制DNA旋转酶和拓扑异构酶IV发挥作用，导致细胞分裂受抑和细菌死亡。大肠杆菌中导致环丙沙星耐药的常见突变包括gyrA1、gyrA2（DNA旋转酶）、parC（拓扑异构酶IV）和marR（AcrAB外排系统阻遏蛋白）的突变。这些突变通常与较野生型更高的MIC值相关，也可能降低细菌适应性。这些突变如何影响描述PK/PD关系的参数，进而影响药物暴露后细菌杀灭的时间进程，是一个值得关注的问题，因为此类信息可为未来研究的设计和给药方案的开发提供有价值的信息。
本研究旨在开发一种基于机制的计算机模型，能够描述大肠杆菌MG1655野生型及六个同基因突变体暴露于环丙沙星后的体外时间-杀灭实验，并寻找可用于简化未来类似研究特征分析的关系。研究调查了特定突变对模型参数的影响，这些参数描述了不同环丙沙星浓度下细菌杀灭的时间进程，并建立了共同的PK/PD模型结构。
材料与方法
体外实验
大肠杆菌菌株与所用抗生素
所用菌株为同基因菌株，仅相差表1所列的突变。其MIC值（Etest法）和适应性值（通过试管生长竞争实验测定）已有报道。所有实验均使用购自Sigma-Aldrich的环丙沙星。抗生素按供应商推荐溶于0.1M HCl，或新鲜配制，或使用保存不超过4周（4°C储存）的10mg/mL储备液。进一步稀释使用Mueller-Hinton II（MHII）肉汤。
MIC测定
既往报道的MIC值采用Etest法测定。本研究中，为反映时间-杀灭实验中的MIC，采用MHII肉汤宏量稀释法测定MIC。所有菌株的宏量稀释MIC（以众数MIC报告）在不同日期、不同实验室至少评估6次。实验使用2mL MHII，起始接种量为2×10⁵cfu/mL。采用2倍半稀释方案，24小时读取结果。为研究实验过程中是否选择出耐药细菌，在野生型细菌的部分0.5-1×MIC实验中对其中一个菌株测定了MIC。
时间-杀灭实验
所有七个菌株的时间-杀灭实验均至少进行三次重复。每个菌株至少有一个重复在三个不同实验室进行，由联合联盟完成，以通过展示实验的可重复性来增强结果的稳健性。实验室之间无明显系统性差异趋势。0.25×至1×MIC浓度之间的高变异性可能源于生物学随机变异（例如影响起始接种量）与微小实验变异（例如温度波动）的结合。通过严格遵循详细的标准操作规程，将实验室间变异降至最低。所有孵育均在37°C进行（液体培养在摇床水浴中以150rpm进行），稀释使用预热的MHII肉汤。从单菌落制备过夜培养物（15-17小时）于2mL MHII中，然后以1:100稀释于2mL MHII肉汤。1.5小时后当培养物达到对数生长期（OD600=0.1-0.3，约10⁷-10⁸cfu/mL）时，进行第二次稀释（1:100，2mL MHII肉汤），以获得约10⁶cfu/mL的起始接种量。提取初始细菌样本后，加入抗生素，使浓度达到该菌株MIC的0×、0.0625×、0.125×、0.25×、0.5×、1×、2×、4×和8×（使用宏量稀释法测定的MIC，见表1）。在加入抗生素后1、2、4、6、9、12和24小时取样。在无菌0.9%NaCl中制备不同稀释液，并对每个取样进行涂板。
样本使用玻璃珠（五颗，Hecht 1401/6）涂布于MHII琼脂平板。约20小时后人工计数菌落。活菌计数的检测限（LOD）为10cfu/mL。抗生素残留效应通过将样本加至平板一侧处理，使抗生素在细菌涂布前沉入琼脂。计数菌落时，对平板上菌落的分布进行目视检查，若存在清晰区域，则将平板一分为二，仅计数未加样本区域的菌落，计数结果加倍以代表整个平板。
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