大鼠骨髓间充质干细胞MSCs生长曲线测定及细胞形态观察
探讨曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)对大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)特化为成骨细胞的影响。方法采用全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠MSCs，进行形态学观察；选择第3代MSCs定向诱导分化为成骨细胞，根据给药浓度不同分为TSA低剂量组(0.1μmol/L)、中剂量组(1μmol/L)、高剂量组(10μmol/L)，同时设立空白对照组。MTT法观察各组对MSCs的增殖作用并绘制细胞生长曲线，检测TSA对MSCs诱导分化为成骨细胞过程中碱性磷酸酶(alkaliphosphatase，ALP)活性的影响；RT-PCR法检测TSA对核心结合因子α-1(corebinding factorα1，Cbfα1)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1，IGF-1)mRNA表达水平的影响。
结果MSCs生长曲线的测定结果显示，各组细胞生长曲线趋势相似，与对照组相比，TSA低剂量组的生长曲线没有显著性变化，TSA中剂量及高剂量均显著促进MSCs增殖(P<0.05)。与对照组相比，TSA低剂量组、中剂量组、高剂量组对MSCs诱导分化为成骨细胞过程中的第4、5、6 E均可显著提高ALP活性(P<0.05)。与空白组相比，TSA各剂量组可以显著提高Cbfα1、bFGF、IGF-1mRNA表达水平(P<0.05)。
MSCs生长曲线的测定：将生长状态良好的第2代MSCs以密度为5×103个接种于96孔培养板中，置于37℃、CO2饱和湿度的5%CO2培养箱中培养，按上述TSA剂量分别加入各组中每天取1板进行MTT检测，连续1周。MTT检测时应用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度值，选择波长为492 nm。按照检测结果，以光吸收值为纵坐标，以细胞生长天数为横坐标，绘制细胞生长曲线。
MSCs细胞形态观察
倒置相差显微镜下可见MSCs为圆形，大小不一，培养24 h后，开始贴壁，呈圆形，梭形，或多角形；5 d后，可见放射状排列的细胞群，多为梭形，胞浆丰富，胞核大，核仁清晰。见图1。
图1 MSCs细胞形态观察图(×1000)Fig.1 MSCs cell morphological observation(×1000)
MSCs生长曲线的测定
各组细胞生长曲线趋势相似，在MSCs接种给药第1、2天为细胞潜伏适应期，而3～6 d曲线呈直线上升，则为MSCs的对数生长期。第7天后曲线上升趋势逐渐变得平缓，MSCs增殖速度明显减慢，进入平台期。与对照组相比，TSA低剂量组的生长曲线没有显著性变化，TSA中剂量及高剂量均有显著升高MSCs生长曲线的趋势，有效增强了MSCs的扩增能力(P<0.05)。见图2。
图2不同组的MSCs生长曲线*P<0.05，与空白对照组比较
结论TSA可显著促进大鼠骨髓间充质干细胞特化为成骨细胞，可能是通过上调Cbfα1、bFGF、IGF-1基因的表达水平实现。