鸽源大肠杆菌分离株对13种抗菌药物耐药现状研究（一）
摘要:为调查广东某肉鸽场大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)的流行情况以及耐药性，该研究从肉鸽直肠内容物中分离大肠杆菌并进行鉴定，采用琼脂稀释法对分离得到的大肠杆菌进行药敏试验，通过PCR检测分离株携带的耐药基因。结果显示，150份样品共分离到120株大肠杆菌;药敏试验结果显示分离株对环丙沙星、氨苄西林等13种抗菌药物不同程度耐药，其中74株大肠杆菌分离株存在多重耐药情况;PCR检测发现具有耐药表型的菌株携带qnrS、blaTEM、blaCTX-M、blaVIM、aacC4和sul1 6种耐药基因。上述结果表明，大肠杆菌分离株对13种抗菌药物不同程度耐药，存在多重耐药现象，且携带多种耐药基因。该研究可为广东省鸽源大肠杆菌的流行情况、耐药现状及临床合理用药提供参考。
引言(Introduction)
近年来，随着国民经济水平的提高以及特禽饲养业的快速发展，肉鸽养殖焕发出蓬勃生机，养殖模式由散养向规模化、集约化方向发展。随着养殖模式的转变、养殖数量的增加、养殖密度的增大，再加上养殖环境的污染，这都促使大肠杆菌病成为危害肉鸽养殖业健康发展的重要细菌性传染病之一，给养鸽业造成了严重的经济损失。各种日龄的鸽均可感染大肠杆菌，主要经呼吸道、消化道引起鸽的腹泻、败血症等局部或者全身性感染，以乳鸽、童鸽、青年鸽的发病较为严重，且死亡率高。
由于E.coli血清型众多且不同血清型之间的交叉保护作用有限，实际生产中疫苗的使用效果不尽人意，因此抗菌药物依然是目前防治鸽大肠杆菌病的主要措施，但随着抗菌药物的长期不合理使用，E.coli的耐药性逐年增加，尤其对传统抗菌药物如氨苄西林、磺胺甲噁唑等的耐药率逐年上升，并且出现多重耐药菌株和超级耐药菌株，极大提高了临床大肠杆菌病的防控难度。E.coli又可以作为耐药基因的储藏库，能以不同途径将其携带的耐药基因进行传播，或随食物链进入人体，严重威胁人类健康和公共卫生安全。
随着不同种类抗菌药物的广泛使用，E.coli亦随即对不同种类抗菌药物产生出不同的耐药机制。E.coli染色体携带耐药突变基因gyrA和parC以及可水平转移的qnrS基因可介导其对喹诺酮类药物产生耐药性。β-内酰胺酶(Extended-Spectrumβ-Lactamases,ESBLs)是当前E.coli耐药性问题的最主要因素，可使β-内酰胺类药物中的β-内酰胺环活性降低，使其产生耐药，由质粒编码的CTX-M型ESBLs不仅对青霉素类耐药，而且对二、三、四代头孢菌素类药物的耐药性也较高。E.coli对氨基糖苷类药物耐药最普遍的机制就是产生药物功能基团灭活酶或称修饰酶(核苷转移酶ANT、乙酰转移酶AAC、磷酸转移酶APH)，可使氨基糖苷类药物的一些结构被修饰、灭活从而产生耐药性。磺胺类药物耐药性的产生主要是二氢叶酸合成酶的生成，使E.coli被抑制的程度下降而产生耐药性，产生这种酶通常与Sul1、Sul2、Sul3这三种耐药基因有关。肠杆菌对黏菌素的耐药性可能是与染色体机制和(或)质粒携带的移动黏菌素抗性基因(mcr)有关，质粒介导耐黏菌素归因于mcr基因，包括mcr-1到mcr-10。
本研究通过无菌方法采集新鲜病死鸽直肠内容物、分离细菌并进行大肠杆菌鉴定，采用琼脂稀释法对分离株进行药敏试验，通过PCR检测分离株携带的常见重要耐药基因，为规模化肉鸽养殖场大肠杆菌的流行情况、耐药现状及临床合理用药提供科学依据和数据支撑。
1材料与方法(Materials and Methods)
1.1主要材料
•病料:来源于广东某规模化肉鸽场疑似细菌感染的新鲜病死鸽150只。
•主要试剂:
•LB肉汤培养基、LB琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基，均购自广东环凯微生物科技有限公司。
•大肠杆菌标准株ATCC25922，由本实验室保存并提供。
•抗菌药物包括环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、氨苄西林(Ampicillin,AMP)、阿莫西林克拉维酸(Amoxicillin Clavulanic acid,AMC)、头孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、头孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、亚胺培南(Imipenem,IPM)、阿米卡星(Amikacin,AMI)、庆大霉素(Gentamicin,GEN)、甲氧苄啶(Trimethoprim,TMP)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SMZ)、黏菌素(Colistin,CL)、氯霉素(Chloramphenicol,CHL)、磷霉素(Fosfomycin,FOS)等13种，均购自北京普博欣生物科技有限责任公司。
•2xFast Taq plus PCR Master、DL2000 DNA Marker、Goldview核酸染料、琼脂糖、细菌基因组DNA提取试剂盒，均购自广州市锐成生物科技有限公司。
•主要仪器:
•超净工作台，购自苏州净化设备有限公司。
•BOD生化培养箱、恒温震荡培养箱，均购自广州恒创实验仪器有限公司。
•MALDI TOF MS质谱仪，购自日本岛津公司。
•PCR扩增仪，购自苏州东胜兴业科学仪器有限公司。
•电泳仪，购自上海伯乐生命医学产品有限公司。
•凝胶成像系统，购自广州誉维生物科技仪器有限公司。
1.2细菌的分离与鉴定
•细菌的分离纯化:无菌采集适量病死鸽直肠中段内容物，置于装有1.0mL PBS的EP管中，震荡摇匀静置后取50μL上清液于麦康凯琼脂平板上，涂布棒涂抹均匀，置37℃培养16-18h，观察分离菌株的形态特征。然后用接种环挑选平板上单个红色圆形菌落采用“Z”字连续划线法再次接种到麦康凯琼脂平板上培养直至纯化。挑选纯化后的单个菌落接种于LB肉汤中，37℃培养16-18h，获得分离株纯培养物，保存备用。
•分离株的鉴定:将获得的分离株纯培养物送至华南农业大学国家兽医微生物耐药性风险评估实验室，采用MALDI TOF MS质谱仪进行菌株鉴定。
1.3耐药表型检测
以大肠杆菌标准株ATCC25922为质控菌株，采用美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐使用的琼脂稀释法测定大肠杆菌分离株的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)，并依据欧盟药敏试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)标准进行药敏试验结果判定。
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