呼宁散对鸡肺源大肠杆菌生长曲线、细胞壁的影响及抑制效果——结果
2结果
2.1呼宁散对鸡肺源大肠杆菌的抑菌效果
如表1所示，鸡肺源大肠杆菌对中药复方呼宁散为中度敏感，表明其有一定的抑菌效果。MIC和MBC结果如图1，随着呼宁散浓度升高，混合液的颜色逐渐变浅，当呼宁散浓度为250 mg·mL-1时，红色沉淀完全消失，混合液变得澄清，测得呼宁散对鸡肺源大肠杆菌的MIC为250 mg·mL-1，MBC为500 mg·mL-1。
表1药敏试验结果(x¯±s)
图1呼宁散(HNP)对鸡肺源大肠杆菌的MIC和MBC
2.2呼宁散对鸡肺源大肠杆菌生长曲线的影响
由图2可知，空白组的细菌生长繁殖较快，10 h之后细菌的生长达到较平稳状态。与空白组相比，呼宁散MIC组和1/2 MIC组作用鸡肺源大肠杆菌24 h内，细菌生长均受到明显抑制(P<0.01)。结果表明，呼宁散对鸡肺源大肠杆菌的生长具有明显的抑制作用。
图2鸡肺源大肠杆菌的生长曲线
2.3呼宁散对鸡肺源大肠杆菌细胞壁的影响
如图3所示，与空白组相比，呼宁散作用6和12 h时，1/2 MIC组和MIC组培养液中AKP活性均极显著升高(P＜0.01)，表明呼宁散能够对鸡肺源大肠杆菌的细胞壁造成破坏。
图3鸡肺源大肠杆菌中AKP活性检测结果
2.4呼宁散对鸡肺源大肠杆菌细胞膜的影响
如图4所示，空白组菌液中的可溶性蛋白含量和核酸含量基本稳定在较低水平，无明显波动。与空白组相比，呼宁散作用6和12 h时，1/2 MIC组和MIC组培养液中的可溶性蛋白含量和核酸含量极显著增加(P＜0.01)。表明呼宁散能够对鸡肺源大肠杆菌的细胞膜造成破坏，导致胞外蛋白浓度升高、核酸外溢。
图4鸡肺源大肠杆菌中可溶性蛋白和核酸含量检测结果
2.5 LPS对DF-1细胞的最低染毒剂量
CCK-8结果如图5所示，当LPS浓度在40μg·mL-1时，细胞存活率显著下降(P<0.05)。因此，本试验选择40μg·mL-1作为LPS诱导DF-1细胞损伤模型的染毒剂量。
图5 LPS对DF-1细胞活力的影响
2.6呼宁散对DF-1细胞的安全给药浓度
CCK-8结果如图6所示，在1.5~2.5 mg·mL-1呼宁散作用下，细胞存活率为80%~95%，且无明显差异性，呼宁散在3 mg·mL-1浓度下细胞活力显著降低(P<0.05)，在4 mg·mL-1呼宁散作用下细胞成活率极显著降低(P<0.01)，说明呼宁散在1~2.5 mg·mL-1浓度对细胞无明显毒性作用，因此本试验选用1.5、2、2.5 mg·mL-1作为呼宁散低、中、高剂量组的给药浓度。
图6呼宁散(HNP)对DF-1细胞活力的影响
2.7呼宁散对LPS致DF-1细胞炎症因子含量的影响
收集各试验组细胞上清液，ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-8的含量。结果如表2所示，与空白组相比，LPS组中IL-1β、IL-8含量均极显著升高(P<0.01)，IL-6含量显著升高(P<0.05)。与LPS组相比，呼宁散低剂量组IL-6、IL-8的含量降低但无显著性差异(P>0.05)，IL-1β的含量极显著降低(P<0.01)；呼宁散中剂量组IL-1β的含量极显著降低(P<0.01)，IL-6含量显著降低(P<0.05)，IL-8的含量降低但无显著性差异(P>0.05)；呼宁散高剂量组IL-1β、IL-6含量均极显著降低(P<0.01)，IL-8的含量显著降低(P<0.05)。表明呼宁散可抑制LPS所致DF-1细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8的过度分泌。
表2 DF-1细胞炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8的含量(x¯±s)
2.8呼宁散对LPS致DF-1细胞TLR4/NF-κB炎性通路关键蛋白表达的影响
Western blot法测定TLR4和细胞核中NF-κB p65的表达，如图7所示，与空白组相比，LPS组TLR4和NF-κB p65蛋白表达极显著升高(P<0.01)。与LPS组相比，呼宁散低、中、高剂量组TLR4表达极显著降低(P<0.01)；呼宁散中剂量组NF-κB p65蛋白表达量极显著降低(P<0.01)，呼宁散低、高剂量组NF-κB p65蛋白表达量降低但无显著性差异(P>0.05)。表明呼宁散可通过调控LPS所致DF-1细胞内炎性通路关键蛋白TLR4和NF-κB p65的表达，增强细胞的抗炎能力。
图7 DF-1细胞TLR4炎症通路关键蛋白Western blot检测结果
2.9呼宁散对LPS致DF-1细胞氧化应激指标及抗氧化物的影响
通过试剂盒检测各组细胞氧化应激指标ROS、MDA及抗氧化物SOD活性、GSH含量。ROS结果如图8所示，与空白组相比，LPS组含量极显著升高(P<0.01)；与LPS组相比，呼宁散低、中、高剂量组ROS含量均极显著降低(P<0.01)。MDA、SOD、GSH结果如表3所示，与空白组相比，LPS组MDA含量极显著升高(P<0.01)，SOD活性极显著降低(P<0.01)，GSH含量显著降低(P<0.05)。与LPS组相比，呼宁散低剂量组MDA含量显著降低(P<0.05)，呼宁散中高剂量MDA含量极显著下降(P<0.01)；呼宁散低剂量组细胞SOD活性极显著升高(P<0.01)，GSH含量升高但无显著性差异(P>0.05)，而呼宁散中、高剂量组细胞SOD活性及GSH含量均极显著升高(P<0.01)。结果表明，呼宁散可降低LPS损伤的DF-1细胞模型内氧化应激指标的含量并增强抗氧化物的含量，缓解LPS所致的细胞氧化损伤。
A.氧化应激指标ROS荧光显微镜检测结果；B.氧化应激指标ROS平均荧光强度；a.空白组(Normal)；b.LPS组；c.呼宁散低剂量组(HNP1.5)；d.呼宁散中剂量组(HNP2)；e.呼宁散高剂量组(HNP2.5)
图8 DF-1细胞内ROS水平
表3 DF-1细胞内MDA、SOD、GSH含量(x¯±s)
2.10呼宁散对LPS致DF-1细胞Keap1/Nrf2氧化通路关键蛋白表达的影响
Western blot法测定Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1的表达量，结果如图9所示，与空白组相比，LPS组Keap1极显著升高(P<0.01)，Nrf2、NQO1极显著降低(P<0.01)，HO-1显著升高(P<0.05)。与LPS组相比，呼宁散低剂量组Keap1降低但无显著性差异(P>0.05)，Nrf2、NQO1、HO-1显著升高(P<0.05)；呼宁散中、高剂量组Keap1极显著降低(P<0.01)，Nrf2、NQO1极显著升高(P<0.01)，HO-1升高但无显著性差异(P>0.05)。结果表明，呼宁散可以通过调控LPS所致DF-1细胞内Keap1/Nrf2信号通路关键蛋白的表达，增强细胞的抗氧化能力。
图9 DF-1细胞Keap1/Nrf2氧化通路关键蛋白Western blot检测结果