耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌生长曲线测定及对线虫毒力作用（一）
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是自然界中常见的革兰氏阴性肠杆菌，主要分布于人体内胃肠道和鼻咽部的正常寄居菌群。当其生态位发生改变或者人体免疫力降低时，可引起肺炎、下尿路感染、菌血症等严重的感染性疾病，是社区和院内感染最常见的机会致病菌之一;尤其对于ICU患者、有手术治疗史及接受气管插管等创伤性操作史的患者，肺炎克雷伯菌感染将带来致命性的后果。然而，随着抗生素的不合理使用，肺炎克雷伯菌对多种抗生素的耐药性正逐年增加，2017年曾倩倩等的回顾性调查发现，肺炎克雷伯菌对头孢吡肟、阿米卡星、头霉素等各类常用抗生素的耐药率也呈不同程度上升，使得碳青霉烯类抗生素成为了对抗肺炎克雷伯菌的最后一道防线。
近十年来耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)的检出率呈逐年上升趋势。这将给临床感染的治疗及控制带来巨大的挑战。有研究报导，我国目前流行的CRKP主要为CG258(Clonal group)克隆的ST11型菌株，占我国CRKP的60%。CRKP的耐药性主要通过菌体产生碳青霉烯酶水解抗生素所赋予，碳青霉烯酶基因通常由CRKP的大型耐药质粒携带，常见的类型包括blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM及blaIMP等。Bedhomme等研究表明大型耐药质粒的携带会带来差异适应性。
由于质粒的运输成本，所以会造成宿主菌适应性的降低，除此之外适应性还与携带耐药基因的质粒拷贝数相关。Newbury等研究也证实了细菌长期暴露于抗生素环境中可能会增加质粒-宿主之间的连接性，其所携带的多个质粒之间会存在互利或拮抗的相互作用。虽然携带耐药基因的大型质粒能为宿主菌带来抗生素耐药性，但如此大型的质粒对宿主菌更广泛的适应性效应及毒力影响尚不明确。本研究主要通过探究携带不同耐药基因的质粒以及携带单个或多个耐药基因的质粒对CRKP环境适应性及毒力作用的影响，以期对临床CRKP的感染控制与治疗提供重要的理论依据和用药指导。
1材料与方法
1.1材料
①细菌及线虫:收集2011年～2015年昆明医科大学第二附属医院CRKP临床分离株共10株。N2野生型秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C.elegans)、大肠杆菌E.coli OP50、肺炎克雷伯菌质控菌株ATCC10031、肺炎克雷伯菌ATCC700603均购自American Type Culture Collection，ATCC(https://www.atcc.org/)。②培养基:NGM线虫培养基配方(1L):NaCl 3 g，蛋白胨2.5 g，琼脂17 g，胆固醇(5 mg/mL，无水乙醇配置，过滤除菌)1 mL，高压灭菌后加入过滤除菌的1 M CaCl21 mL，1 M MgSO41 mL，1 M磷酸盐缓冲液(pH=6.0)10 mL倒入平板，过夜晾干后加适量E.coli OP50单克隆菌液制成NGM发育板上，加适量CRKP分离株的单克隆菌液制成NGM检测板备用;LB液体及固体培养基按常规方法配置。③主要试剂及缓冲液:M9缓冲液(1 L):七水磷酸氢二钠5.8 g，磷酸二氢钠3.0 g，氯化钠5.0 g，七水硫酸镁0.25 g，添加ddH2O至1 L，高压蒸汽灭菌备用;线虫Bleach裂解液(100 mL体系):5 M NaOH 10 mL，次氯酸钠20 mL(5%有效氯含量)，ddH2O 70 mL，4℃避光储存备用;1 M磷酸盐缓冲液(pH=6.0):KH2PO4117.3 g，K2HPO424.0 g，添加ddH2O至1 L，高压灭菌备用;线虫冻存液(1 L):NaCl 5.85 g，KH2PO46.80 g，甘油300 mL，1 M NaOH 5.60 mL，灭菌后加入0.3 mL无菌1M MgSO4备用。
1.2细菌耐药基因型鉴定
根据检验科VITEK平台的药敏及菌种鉴定结果，收集昆明医科大学第二附属医院CRKP临床分离株10株，根据《全国临床检验规程》对菌株进行分离、纯化、保菌备用。采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，利用PCR技术对碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM、blaIMP，β-内酰胺类耐药基因blaTEM、blaSHV、blaCTX、blaLAP进行扩增，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，随后对阳性条带进行测序、Blastn比对分析。肺炎克雷伯菌ATCC10031、ATCC700603作为对照菌株。见表1。
表1各耐药基因PCR引物
1.3菌种鉴定及MLST分型
扩增16S rRNA基因，sanger双向测序后进行Blastn比对分析，鉴定菌种;PCR扩增七个管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB)，sanger双向测序后通过等位基因数据库比对鉴定其ST类型(http://bigsdb.web.pasteur.fr/)。
1.4细菌生长曲线测定
分离纯化后的菌株从-80℃取出，接种于5 mL未添加亚胺培南抗生素的LB液体培养基中，200 rpm，37℃摇菌复苏培养4 h。将复苏后的细菌在无抗性LB平板上划线过夜培养，挑取单克隆菌落在5 mL无抗LB液体培养基中增殖培养8～12 h，待细菌进入指数生长期后，用无菌PBS稀释菌液至OD600=0.1(MCF=0.13～0.14)，取稀释后的菌液50μL接种至加有5 mL LB液体培养基的浊度瓶中，加入亚胺培南抗生素，浓度分别为:0、2和8 mg/mL，200 rpm，37℃摇菌培养。测定浊度瓶初始MCF值，之后每隔30 min测定一次MCF值，连续测定24 h。每个分离株的各抗生素浓度组平行培养2瓶，整体实验重复两次。利用GraphPad Prism 6.0软件绘制生长曲线，采用Kruskal-Wallis检验法对组间数据进行差异显著性分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
相关新闻推荐
1、不同条件下裂片石莼水培液的组成成分对耐药弧菌株的抑菌作用（二）
2、产单核细胞李氏杆菌噬菌体分离、超离、宿主谱鉴定及生长曲线绘制（一）
3、大黄鱼病原性哈维氏弧菌在试验菌发酵上清液拮抗下的生长曲线