双峰驼永生化成纤维细胞系的建立方法
体外培养的细胞寿命一般较短，是影响研究稳定性的关键因素之一。尤其像双峰驼，主要分布于我国甘肃、青海、新疆、内蒙古等地，对荒凉、贫瘠、严酷的环境有良好的适应能力，与其他动物相比有难以比拟的优越性。由于种群稀少、采样困难、缺乏稳定的细胞资源，双峰驼(camelus bactrianus)原代细胞传代困难，容易衰老，相关的试验材料及可供参考的资料也非常有限。因此，构建双峰驼永生化细胞系十分重要。而成纤维细胞是一种生长分裂能力较强且功能旺盛的细胞，存在范围广、易获取，是试验研究中常用的细胞之一，但也同样会面临衰老、无法多次传代等问题。染色体末端存在着由多条长度不同的DNA重复序列以及蛋白质组成的复合体，称为“端粒”，它能够维持染色体位置和结构稳定，防止染色体酶解，促进细胞正常生长。正常的体细胞染色体末端的端粒会逐渐缩短，且传代次数有限，所以端粒对于染色体有重要的保护作用。目前，已经有很多物种成功建立起了永生化细胞系，而且方法多种多样，通过自发永生化、过表达端粒酶逆转录酶(TERT,telomerase reverse transcriptase)或者病毒癌基因、突变p53和pRb基因、放射法等均可实现，其中使用最广泛、报道最多的便是过表达hTERT。已有研究表明，在奶山羊间充质干细胞、田鼠胚胎成纤维细胞，不同物种的组织细胞中转入hTERT，细胞能够传代至50～80代，并且细胞生物学特性在传代过程中保持稳定，表明成功建立永生化细胞系。
现有技术存在的问题：由于目前还没有双峰驼永生化细胞系，且前人转入hTERT成功建立细胞系，说明此法是可行的、有效的。为了解决双峰驼研究面临的问题，本试验拟通过pCI-neo-hTERT质粒载体转染Primary BCFs建立永生化细胞系，并从形态学、mRNA水平、蛋白质水平分析hTERT介导的细胞永生化，为以后开展双峰驼的相关研究提供理论基础。
双峰驼永生化成纤维细胞系的建立方法，具体步骤如下：(1)原代细胞的分离培养，(2)细胞复苏、传代培养与冻存，(3)细胞生长的最适血清与糖浓度测定，(4)pCI-neo-hTERT载体构建和G418最佳浓度筛选及细胞转染，(5)形态学观察，(6)生长曲线绘制，(7)免疫荧光检测，(8)实时荧光定量PCR检测，(9)Western Blot检测，(10)细胞周期检测。
图1为不同代次BCFs细胞形态；其中，图1A：BCFs-P5代细胞生长形态；图1B：BCFs-P10代细胞生长形态；图1C：BCFs-P20代细胞生长形态；图1D：BCFs-P30代细胞生长形态；图1E：BCFs-P40代细胞生长形态；图1F：BCFs-P50代细胞生长形态；图1G：BCFs-P60代细胞生长形态；图1H：BCFs-P70代细胞生长形态；图1I：BCFs-P80代细胞生长形态，100×，标尺：100μm。
图2为Primary BCFs与BCFs Cell lines的生物学特性分析；图2A：流式细胞仪检测BCFs-P3与BCFs-P80细胞周期分布；图2B：流式细胞仪检测BCFs-P3与BCFs-P80细胞G1与S期细胞占比表；图2C：血细胞计数法绘制BCFs-P3与BCFs-P80生长曲线；图2D：CCK-8法绘制BCFs-P3与BCFs-P80生长曲线。
双峰驼永生化成纤维细胞系的建立和检测结果，具体如下：
1.原代细胞形态学观察结果
胶原酶消化法分离原代细胞，刚接种于培养瓶中，细胞还未贴壁，圆形液滴状细胞均匀的悬浮在溶液中，形态未明，贴壁培养1h后，观察到细胞正在进行贴壁运动，某些细胞表面部分贴壁，胞质渐渐平摊在瓶底上，折光率开始下降。培养4h后，细胞表面大部分贴壁，24h后大多数细胞完成贴壁，胞质均匀平摊，细胞形态多为长梭形、多角形、圆形等。在Primary BCFs传代过程中发现从第BCFs-P10左右开始，与BCFs-P5相比细胞形态严重异常，细胞开始出现衰老和变形，并且伴随着生长停滞、脱落、死亡等现象。
2.G418筛选结果
双峰驼BCFs经筛选培养基筛选2周后，根据细胞的生长状况，可以得到使所有双峰驼BCFs死亡的最小浓度为400ng/μL，最终筛选阳性克隆时应将浓度提高50ng/μL。因此，450ng/μL可作为Primary BCFs G418筛选阳性细胞的最佳浓度。
3.pCI-neo-hTERT质粒的获得与鉴定结果
试验所用pCI-neo-hTERT质粒经加入酶切位点后得到质粒，质粒提取试剂盒提取纯化后，使用超微量紫外分光光度计检测得到OD260/OD280为1.838，质粒浓度为673.5ng/μL，说明所提取的质粒纯度较高，没有明显的蛋白质、RNA、酚类物质、胍盐等污染，满足后续细胞转染需要。质粒经双酶切鉴定。
4细胞生长最适血清与糖浓度确定
CCK-8法检测细胞生长对血清及糖浓度的依赖性，结果：BCFs-P3与BCFs-P80对血清的依赖性相似。试验中发现BCFs-P3与BCFs-P80皆不能在无血清的环境中生长，在无血清条件下培养24h即有细胞脱落、死亡。5％FBS、10％FBS、15％FBS均可明显提高Primary BCFs与BCFs Cell lines的分裂能力(P＆lt;0.05)。说明Primary BCFs与BCFsCell lines均具有血清依赖性，血清是促进细胞生长分裂的重要因素之一，且10％FBS为该细胞培养的最佳血清浓度。以同样的方法检测了培养基中葡萄糖浓度对细胞生长的影响，结果：BCFs-P3与BCFs-P80对培养基中糖浓度的依赖性一致，与4.5g/L相比，0g/L、2g/L和9g/L糖浓度条件下细胞增殖能力显著下降(P＆lt;0.01)，说明BCFs-P3与BCFs-P80在过低或过高糖浓度的环境下细胞分裂均会受到阻碍，促进细胞生长的培养基最适糖浓度为4.5g/L。
5细胞形态学观察结果
在永生化细胞系的建立过程中，利用德国ZEISS倒置显微镜成像系统记录了形态良好、具有典型成纤维细胞特征的双峰驼Primary BCFs与BCFs Cell lines。如图1A：BCFs-P5代细胞生长形态；图1B为BCFs-P10代细胞生长形态；图1C为BCFs-P20代细胞生长形态；图1D为BCFs-P30代细胞生长形态；图1E：BCFs-P40代细胞生长形态；图1F为BCFs-P50代细胞生长形态；图1G为BCFs-P60代细胞生长形态；图1H为BCFs-P70代细胞生长形态；图1I为BCFs-P80代细胞生长形态。Primary BCFs传代到第10代左右，细胞形态开始出现异常，逐渐变得细长、活力下降，并且伴随着贴壁能力减弱、生长停滞等细胞衰老的现象。在不断转染hTERT质粒后细胞形态逐渐开始稳定，细胞死亡率下降，由此可以推测转染hTERT质粒后已初步构建双峰驼永生化细胞系。
6.实时荧光定量PCR、免疫荧光及Western Blot鉴定Primary BCFs与BCFs Celllines
波形蛋白(vimentin,VIM)是成纤维细胞的特异性标志物之一，是中间丝蛋白的其中一种，通过细胞免疫荧光染色来检测成纤维细胞特性，在荧光显微镜下显示BCFs-P3与BCFs-P80大多数胞质呈绿色(黑白图为较亮处)荧光，细胞核DAPI染色呈蓝色(黑白图为较亮处)，波形蛋白染色为阳性。细胞界限清晰，大小均一，表现出成纤维细胞特性。而角蛋白18(CK18)是上皮细胞特异性标志物之一，VIM和CK18实时荧光定量PCR鉴定结果，以MAC-T上皮细胞为阳性对照，Primary BCFs与BCFs Cell lines各代次VIM相对表达量较高，而CK18的相对表达量较低。表明Primary BCFs细胞仍为混合细胞，存在上皮样细胞，但经转染hTERT以及G418筛选后BCFs Cell lines各代次纯度越来越高，BCFs Cell lines大部分为成纤维细胞。Western Blot结果与实时荧光定量PCR结果一致，表明BCFs Cell lines为成纤维细胞。
7.Primary BCFs与BCFs Cell lines的生物学特性分析及外源性hTERT的整合与表达
分别利用CCK-8法与血细胞计数法对Primary BCFs与BCFs Cell lines进行活力测定。从图2C、D可知，双峰驼BCFs-P3与BCFs-P80的生长曲线均呈“S”型，在培养1～2d时，细胞数量没有太大的变化，此时的细胞处于潜伏期；培养了3d后细胞开始快速生长，此时进入对数生长期；培养6d时，细胞分裂能力减弱，生长速度减缓；培养7～8d时，细胞数量基本维持不变，此时细胞生长进入了平台期。BCFs传至10代左右时，其分裂能力开始下降，表明了BCFs经过多次传代后细胞逐渐出现了衰老、变形等问题。流式细胞术检测细胞生长周期结果如图2A和表B所示：BCFs-P3处于G1期的细胞比例为82.95％a，处于S期的细胞为8.12％b；BCFs-P80处于G1期的细胞比例为50.46％a，S期的细胞为39.83％b，且差异显著(P＆lt;0.05)。该结果表明：BCFs-P80在G1期的生长停滞比例显著低于BCFs-P3，且BCFs-P80在S期的细胞占比显著高于BCFs-P3，再结合BCFs-P3与BCFs-P80的生长曲线可以证明BCFs Cell lines细胞分裂增殖能力更强，增殖速度更快，BCFs Cell lines并不受S期阻滞，增值活力旺盛。
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