欢迎来到BioSense网站!

热线:021-66110810, 66110819, 13564362870

邮箱:info@vizai.cn

双峰驼永生化成纤维细胞系的建立方法

来源:甘肃农业大学 发布时间:2024-07-15 22:33:30 浏览:11 次

体外培养的细胞寿命一般较短,是影响研究稳定性的关键因素之一。尤其像双峰驼,主要分布于我国甘肃、青海、新疆、内蒙古等地,对荒凉、贫瘠、严酷的环境有良好的适应能力,与其他动物相比有难以比拟的优越性。由于种群稀少、采样困难、缺乏稳定的细胞资源,双峰驼(camelus bactrianus)原代细胞传代困难,容易衰老,相关的试验材料及可供参考的资料也非常有限。因此,构建双峰驼永生化细胞系十分重要。而成纤维细胞是一种生长分裂能力较强且功能旺盛的细胞,存在范围广、易获取,是试验研究中常用的细胞之一,但也同样会面临衰老、无法多次传代等问题。染色体末端存在着由多条长度不同的DNA重复序列以及蛋白质组成的复合体,称为“端粒”,它能够维持染色体位置和结构稳定,防止染色体酶解,促进细胞正常生长。正常的体细胞染色体末端的端粒会逐渐缩短,且传代次数有限,所以端粒对于染色体有重要的保护作用。目前,已经有很多物种成功建立起了永生化细胞系,而且方法多种多样,通过自发永生化、过表达端粒酶逆转录酶(TERT,telomerase reverse transcriptase)或者病毒癌基因、突变p53和pRb基因、放射法等均可实现,其中使用最广泛、报道最多的便是过表达hTERT。已有研究表明,在奶山羊间充质干细胞、田鼠胚胎成纤维细胞,不同物种的组织细胞中转入hTERT,细胞能够传代至50~80代,并且细胞生物学特性在传代过程中保持稳定,表明成功建立永生化细胞系。


现有技术存在的问题:由于目前还没有双峰驼永生化细胞系,且前人转入hTERT成功建立细胞系,说明此法是可行的、有效的。为了解决双峰驼研究面临的问题,本试验拟通过pCI-neo-hTERT质粒载体转染Primary BCFs建立永生化细胞系,并从形态学、mRNA水平、蛋白质水平分析hTERT介导的细胞永生化,为以后开展双峰驼的相关研究提供理论基础。


双峰驼永生化成纤维细胞系的建立方法,具体步骤如下:(1)原代细胞的分离培养,(2)细胞复苏、传代培养与冻存,(3)细胞生长的最适血清与糖浓度测定,(4)pCI-neo-hTERT载体构建和G418最佳浓度筛选及细胞转染,(5)形态学观察,(6)生长曲线绘制,(7)免疫荧光检测,(8)实时荧光定量PCR检测,(9)Western Blot检测,(10)细胞周期检测。


图1为不同代次BCFs细胞形态;其中,图1A:BCFs-P5代细胞生长形态;图1B:BCFs-P10代细胞生长形态;图1C:BCFs-P20代细胞生长形态;图1D:BCFs-P30代细胞生长形态;图1E:BCFs-P40代细胞生长形态;图1F:BCFs-P50代细胞生长形态;图1G:BCFs-P60代细胞生长形态;图1H:BCFs-P70代细胞生长形态;图1I:BCFs-P80代细胞生长形态,100×,标尺:100μm。


图2为Primary BCFs与BCFs Cell lines的生物学特性分析;图2A:流式细胞仪检测BCFs-P3与BCFs-P80细胞周期分布;图2B:流式细胞仪检测BCFs-P3与BCFs-P80细胞G1与S期细胞占比表;图2C:血细胞计数法绘制BCFs-P3与BCFs-P80生长曲线;图2D:CCK-8法绘制BCFs-P3与BCFs-P80生长曲线。


双峰驼永生化成纤维细胞系的建立和检测结果,具体如下:


1.原代细胞形态学观察结果


胶原酶消化法分离原代细胞,刚接种于培养瓶中,细胞还未贴壁,圆形液滴状细胞均匀的悬浮在溶液中,形态未明,贴壁培养1h后,观察到细胞正在进行贴壁运动,某些细胞表面部分贴壁,胞质渐渐平摊在瓶底上,折光率开始下降。培养4h后,细胞表面大部分贴壁,24h后大多数细胞完成贴壁,胞质均匀平摊,细胞形态多为长梭形、多角形、圆形等。在Primary BCFs传代过程中发现从第BCFs-P10左右开始,与BCFs-P5相比细胞形态严重异常,细胞开始出现衰老和变形,并且伴随着生长停滞、脱落、死亡等现象。


2.G418筛选结果


双峰驼BCFs经筛选培养基筛选2周后,根据细胞的生长状况,可以得到使所有双峰驼BCFs死亡的最小浓度为400ng/μL,最终筛选阳性克隆时应将浓度提高50ng/μL。因此,450ng/μL可作为Primary BCFs G418筛选阳性细胞的最佳浓度。


3.pCI-neo-hTERT质粒的获得与鉴定结果


试验所用pCI-neo-hTERT质粒经加入酶切位点后得到质粒,质粒提取试剂盒提取纯化后,使用超微量紫外分光光度计检测得到OD260/OD280为1.838,质粒浓度为673.5ng/μL,说明所提取的质粒纯度较高,没有明显的蛋白质、RNA、酚类物质、胍盐等污染,满足后续细胞转染需要。质粒经双酶切鉴定。


4细胞生长最适血清与糖浓度确定


CCK-8法检测细胞生长对血清及糖浓度的依赖性,结果:BCFs-P3与BCFs-P80对血清的依赖性相似。试验中发现BCFs-P3与BCFs-P80皆不能在无血清的环境中生长,在无血清条件下培养24h即有细胞脱落、死亡。5%FBS、10%FBS、15%FBS均可明显提高Primary BCFs与BCFs Cell lines的分裂能力(P<0.05)。说明Primary BCFs与BCFsCell lines均具有血清依赖性,血清是促进细胞生长分裂的重要因素之一,且10%FBS为该细胞培养的最佳血清浓度。以同样的方法检测了培养基中葡萄糖浓度对细胞生长的影响,结果:BCFs-P3与BCFs-P80对培养基中糖浓度的依赖性一致,与4.5g/L相比,0g/L、2g/L和9g/L糖浓度条件下细胞增殖能力显著下降(P<0.01),说明BCFs-P3与BCFs-P80在过低或过高糖浓度的环境下细胞分裂均会受到阻碍,促进细胞生长的培养基最适糖浓度为4.5g/L。


5细胞形态学观察结果


在永生化细胞系的建立过程中,利用德国ZEISS倒置显微镜成像系统记录了形态良好、具有典型成纤维细胞特征的双峰驼Primary BCFs与BCFs Cell lines。如图1A:BCFs-P5代细胞生长形态;图1B为BCFs-P10代细胞生长形态;图1C为BCFs-P20代细胞生长形态;图1D为BCFs-P30代细胞生长形态;图1E:BCFs-P40代细胞生长形态;图1F为BCFs-P50代细胞生长形态;图1G为BCFs-P60代细胞生长形态;图1H为BCFs-P70代细胞生长形态;图1I为BCFs-P80代细胞生长形态。Primary BCFs传代到第10代左右,细胞形态开始出现异常,逐渐变得细长、活力下降,并且伴随着贴壁能力减弱、生长停滞等细胞衰老的现象。在不断转染hTERT质粒后细胞形态逐渐开始稳定,细胞死亡率下降,由此可以推测转染hTERT质粒后已初步构建双峰驼永生化细胞系。


6.实时荧光定量PCR、免疫荧光及Western Blot鉴定Primary BCFs与BCFs Celllines


波形蛋白(vimentin,VIM)是成纤维细胞的特异性标志物之一,是中间丝蛋白的其中一种,通过细胞免疫荧光染色来检测成纤维细胞特性,在荧光显微镜下显示BCFs-P3与BCFs-P80大多数胞质呈绿色(黑白图为较亮处)荧光,细胞核DAPI染色呈蓝色(黑白图为较亮处),波形蛋白染色为阳性。细胞界限清晰,大小均一,表现出成纤维细胞特性。而角蛋白18(CK18)是上皮细胞特异性标志物之一,VIM和CK18实时荧光定量PCR鉴定结果,以MAC-T上皮细胞为阳性对照,Primary BCFs与BCFs Cell lines各代次VIM相对表达量较高,而CK18的相对表达量较低。表明Primary BCFs细胞仍为混合细胞,存在上皮样细胞,但经转染hTERT以及G418筛选后BCFs Cell lines各代次纯度越来越高,BCFs Cell lines大部分为成纤维细胞。Western Blot结果与实时荧光定量PCR结果一致,表明BCFs Cell lines为成纤维细胞。


7.Primary BCFs与BCFs Cell lines的生物学特性分析及外源性hTERT的整合与表达


分别利用CCK-8法与血细胞计数法对Primary BCFs与BCFs Cell lines进行活力测定。从图2C、D可知,双峰驼BCFs-P3与BCFs-P80的生长曲线均呈“S”型,在培养1~2d时,细胞数量没有太大的变化,此时的细胞处于潜伏期;培养了3d后细胞开始快速生长,此时进入对数生长期;培养6d时,细胞分裂能力减弱,生长速度减缓;培养7~8d时,细胞数量基本维持不变,此时细胞生长进入了平台期。BCFs传至10代左右时,其分裂能力开始下降,表明了BCFs经过多次传代后细胞逐渐出现了衰老、变形等问题。流式细胞术检测细胞生长周期结果如图2A和表B所示:BCFs-P3处于G1期的细胞比例为82.95%a,处于S期的细胞为8.12%b;BCFs-P80处于G1期的细胞比例为50.46%a,S期的细胞为39.83%b,且差异显著(P<0.05)。该结果表明:BCFs-P80在G1期的生长停滞比例显著低于BCFs-P3,且BCFs-P80在S期的细胞占比显著高于BCFs-P3,再结合BCFs-P3与BCFs-P80的生长曲线可以证明BCFs Cell lines细胞分裂增殖能力更强,增殖速度更快,BCFs Cell lines并不受S期阻滞,增值活力旺盛。


相关新闻推荐

1、保加利亚乳杆菌L2生长曲线

2、​OD600是什么意?OD600测量细胞浓度的原理

3、温带的蜡样芽孢杆菌噬菌体分离与鉴定

4、益生菌发酵葡萄糖酸钠母液生长曲线测定与分析

5、改良肉汤连续继代培养血清型大肠杆菌生长曲线绘制