金黄色葡萄球菌PFGE分型、分布特征及药敏情况（一）
近年来，随着医疗相关的诊疗操作数量的上升，医院获得性感染已成为全球性问题。脑血管病患者多数伴大脑功能缺陷，意识出现障碍，生活不能自理，吞咽功能、咳嗽反射受损，呕吐物或食物返流可导致肺部感染，继发肺部感染是脑血管病患者死亡的重要原因。金黄色葡萄球菌作为临床常见的机会致病菌，是引起医院获得性肺炎的主要革兰阳性球菌。金黄色葡萄球菌可通过接触、水和食物等在人与人、手与物、物与物之间传播，特别是目前多重耐药菌（MDRO）已经成为世界性公共卫生问题的形势下，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在医疗环境中的传播给患者带来极大的感染风险，同时由于抗菌药物选择的局限性，也伴随着治疗困难和经济损失。
近期，海军军医大学第一附属医院脑血管外科病区在两周内相继从2例患者的痰中检出金黄色葡萄球菌，样本采集均为住院48 h后，其中1例为气管切开术后，且此2例患者的床位相邻。为了排除和预防环境因素引起的医院感染，对该科室的医务人员和环境进行重点部位调查采样，分析该病区环境中金黄色葡萄球菌分布特征。
1材料与方法
1.1样本来源
对脑血管外科某日在岗工作的医师、护士、工勤人员的咽部、手、工作服和病员床单元物体表面、工作站物体表面进行采样。
1.2方法
1.2.1采样与培养使用浸湿生理盐水或含中和剂的肉汤（青岛海博生物技术有限公司）的棉拭子对医护工勤人员的咽部、手、工作服、床单元物表、护士站物表进行采样。咽拭子采用四区划线直接涂抹接种哥伦比亚血、麦康凯和巧克力琼脂平板（上海科玛嘉微生物技术有限公司），用于条件致病菌培养。其余类型样本各采集两份，第一份采用四区划线直接涂抹接种哥伦比亚血琼脂平板和麦康凯琼脂平板，用于筛选条件致病菌。第二份将棉拭子手接触部分折断后放入含复方中和剂的无菌培养基中，2 h内按照规范进行接种，用于菌落计数，按相关标准≤10 CFU/cm2为合格。两种方法接种后的培养基放入（36±1）℃恒温培养箱，24 h后对直接接种平板上的疑似致病菌进行纯分之后鉴定，48 h后对菌落计数法的平板进行判读。咽拭子采样、分区划线法接种和结果判读参照《全国临床检验操作规程》（第4版），手、物表采样和菌落计数法结果判读参照相应规范。医院医用织物洗涤消毒技术规范WS/T508-2016仅对清洗后的工作服有微生物菌落数要求，对工作状态下穿用的工作服未做要求和规范，故本研究对此类样本仅计算菌落数，不做合格性判断。
1.2.2菌株鉴定与药敏试验采用微生物质谱仪器（德国Bruker）对疑似致病菌进行鉴定，对分离出的金黄色葡萄球菌采用纸片扩散法进行甲氧西林（头孢西丁纸片法，英国OXOID）药敏试验，参照美国临床和实验室标准化协会（CLSI）2020年M100文件判读药敏结果。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 25923。
1.2.3脉冲场凝胶电泳（PFGE）将待测金黄色葡萄球菌接种于平板，35℃培养过夜，用bioMérieux DENSIMAT比浊仪调整细菌悬液浓度，使浊度为6.0～6.5麦氏浊度。加入1%Seakem Gold：1%SDS胶，混匀制备胶块。使用含蛋白酶K的细胞裂解液（CLB）54℃消化3 h，纯水清洗胶块2次，TE（10 mmol/L Tris：1 mmol/L EDTA，pH值8.0）清洗胶块4次，60 U SmaI（NEB公司）内切酶25℃酶切4～5 h。在CHEF-DRⅢ（Bio-Rad Laboratories公司）电泳仪中进行脉冲场电泳。电泳参数为4～40 s，19 h。电泳结束后，使用GelRed核酸染料染色，在读胶仪中成像，PFGE图像录入BioNumerics软件进行聚类分析。分子量标准为H9812经过XbaI酶切后的片段。
2结果
2.1样本菌落数不合格情况和病原菌分布
2.1.1菌落数从医务人员和物体表面环境中共采集菌落计数样本88份，见表1。其中手12份，工作服12份，物体表面64份。手和床单元物表菌落数不合格率分别为66.7%（8/12）和13.7%（7/51），护士站物表菌落数不合格率为0。2位护工手的菌落数均较高，其中1位高达100.0 CFU/cm2，3位医师手的菌落数分别为12.0、40.0、56.7 CFU/cm2，护士手的菌落数范围为0～50.0 CFU/cm2，床单元和护士站物体表面菌落数范围分别为0～30.0 CFU/cm2和0～9.6 CFU/cm2，工作服菌落数为0.8～29.4 CFU/cm2。床单元物表菌落数不合格的7份分别为：监护仪按钮（1份）、氧饱和度探头（3份）、床栏（2份）、床头柜台面（1份）。护士站物表菌落数最高的为ICU护士站桌面，为9.6 CFU/cm2。
表1脑血管外科病区环境样本的微生物菌落数不合格情况
2.1.2病原菌分布金黄色葡萄球菌在医务人员和工勤人员的咽拭子、手、工作服、地面、患者床单元物表均有检出，总检出率为17.8%（18/101），见表2。医务人员咽拭子、手和工作服检出率分别为7.7%（1/13）、25.0%（3/12）和33.3%（4/12），护士站和床单元物表检出率分别为38.5%（5/13）和9.8%（5/51），具体分布为1名护士咽拭子、1名医师手、2名护士手、3名护士工作服、1名护工工作服、护士站物体表面5处和床单元物体表面5处。此外，皮氏不动杆菌在氧饱和度探头、呼吸机按钮、地面和墙面多处中检出，产气克雷伯菌在隔帘上检出，肺炎克雷伯菌、日勾维肠杆菌、停乳链球菌、鲍曼不动杆菌、解甘露醇罗尔斯顿菌在医务人员的咽拭子中检出。
表2脑血管外科病区环境样本的病原菌检出情况
2.2金黄色葡萄球菌药敏试验结果
从不同来源分离出的21株金黄色葡萄球菌对甲氧西林的药物敏感性见图1。其中，分离于护士站地面的菌株为MRSA，其余从环境中分离出的菌株均为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）。从该科室患者P1和P2痰中分离出的3株金黄色葡萄球菌（S7、S8和S9）均为MRSA。
图1金黄色葡萄球菌PFGE聚类分析图以及菌株药敏情况
2.3金黄色葡萄球菌PFGE分型
PFGE结果显示，21株金黄色葡萄球菌分为13个PT型：患者痰包含2个型别（PT05和PT06），咽拭子包含1个型别（PT02），手包含3个型别（PT04、PT09和PT12），工作服包含3个型别（PT01、PT04和PT11），见图1。ICU护士站橱柜把手和护工HW1工作服上检出的金黄色葡萄球菌型别一致（PT01），且与护士N2咽拭子检出的金黄色葡萄球菌型别（PT02）相似度高（89.7%）。护士N3的手和工作服上检出的金黄色葡萄球菌型别一致（PT04），且与患者P1痰中两次时间点检出的金黄色葡萄球菌（S7和S8）型别（PT05）相似度高，为91.1%。患者P2痰中检出金黄色葡萄球菌S9型别（PT06）与病区护士站地面金黄色葡萄球菌型别（PT07）高度相似（92.9%）。但2例患者检出的菌株型别（PT05和PT06）差距较大。患者P4床头柜和其床旁椅子上检出的金黄色葡萄球菌型别一致（PT08）。ICU护士站键盘和文具与患者P3使用的监护仪按钮上检出的金黄色葡萄球菌型别一致（PT10）。患者P5床头柜台面、护士N5工作服、ICU护士N1工作服检出的金黄色葡萄球菌型别一致（PT11）。
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