3讨论

在临床抗感染治疗过程中，药敏实验可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药物的敏感性，来指导临床合理用药，以实现精准治疗。临床常规药敏试验包括纸片琼脂扩散法(K-B法)、稀释法(包括肉汤稀释法和琼脂稀释法)、E-test法、Vitek、Microscan、PHOENIXTM System、AST等自动化药敏分析仪，但都需要较长的孵育时间或高紧密性仪器，从而延迟致病菌感染的有效治疗。ATP是生物体内能量转换最基本的载体，同时也是萤火虫荧光素酶催化发光产生荧光的条件之一，活菌体内ATP水平处于相对稳定的动态平衡，其含量可以作为细菌生长及细菌计数的指标。钟敏等建立了荧光素酶催化反应快速测定结核分枝杆菌药敏结果的试验方法，在(6.6±2.1)d内获得的药敏结果与罗氏培养法符合率为95.2%。为适应临床治疗的迫切性，本研究基于荧光素酶催化反应和自动化仪器试验进行优化，相比于传统培养对微量肉汤法药敏时缩短至6 h内，利用荧光素酶反应体系和细菌生长繁殖或裂解后释放出的ATP反应发射荧光，可直接、准确测定MIC，可为临床医生提供及时的用药方案，有效降低患者感染死亡率。

表3 临床革兰阳性菌荧光法与微量肉汤法药敏结果

革兰阳性菌	例数/株	头孢西丁%		庆大霉素%		红霉素%		万古霉素%		呋喃妥因%		利奈唑胺%
		EA	CA	EA	CA	EA	CA	EA	CA	EA	CA	EA	CA
金黄色葡萄球菌	18	100.00	100.00	100.00	100.00	83.33	83.33	100.00	100.00	100.00	88.89	94.44	100.00
表皮葡萄球菌	18	94.44	88.89	100.00	100.00	94.44	94.44	100.00	100.00	100.00	88.89	93.30	94.44
粪肠球菌	22	100.00	/	95.45	/	95.45	95.20	100.00	100.00	90.00	66.67	100.00	95.50
屎肠球菌	21	100.00	/	95.23	/	95.24	83.71	50.08	100.00	100.00	68.24	100.00	100.00
肺炎链球菌	14	90.00	/	93.75	/	100.00	100.00	100.00	100.00	/	78.75	100.00
总计	93	97.39	94.44	96.29	100.00	93.54	93.04	97.85	100.00	97.35	84.81	92.97	90.32
注：“/”代表该药敏无试验数据

本研究利用荧光素酶生物发光法对大肠埃希菌ATCC29292、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC29213、粪肠球菌ATCC29212与筛选的抗生素相互作用产生荧光，建立反应体系及发光曲线模型，根据荧光折点定义MIC。经检测发现荧光素酶生物发光法检测上述菌株对10抗生素的MIC与微量肉汤药敏实验结果一致性为100%。为进一步验证该方法的可行性及准确性，筛选了184株临床分离菌株，包含金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和屎肠球菌等在内的93株革兰阳性菌，和包含大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌等91株革兰阴性菌，其中革兰阳性菌荧光素酶生物发光法与微量肉汤肉汤对比EA和CA值有较高的符合率，但呋喃妥因对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌出现较低的分类结果，可能由于呋喃妥因肠球菌类抗菌药，其作用机制为干扰细菌体内氧化还原酶系统，其氧化还原能力与ATP含量无强相关性影响。

利奈唑胺为恶唑烷酮类抗生素，通过作用于细菌50s核糖体亚单位抑制蛋白质的合成，在与粪肠球菌作用中表现出较低的CA值(仅为66.67%)，可能与利奈唑胺抑菌生长作用相关，需忽略部分荧光信号。

革兰阴性菌对比EA和CA值分别大于90%和80%，其中假单胞菌属为专性需氧菌，培养前期生长缓慢延迟期较长，需适当延长孵育时间，减少假阴性孔的产生。同时有研究表明部分抗生素作用细菌可伴随快速生长(relative rapid growth，RRG)，如环丙沙星和苯唑西林；和相对低速生长(relative slow growth，RSG)，如红霉素和利奈唑胺。RRG和RSG现象可导致依赖检测生物量或次级代谢产物原理的快速药物敏感性测试方法(如荧光素酶生物发光法)对部分浓度的抗生素孔出现假阳或假阴的判断，降低测试符合率，但可通过延长孵育时间或修正对应抗生素的判读规则进行改正。

综上所述，该研究认为荧光素酶生物发光法主要通过检测荧光折点判断MIC，可实现连续监测并具有良好的准确性，判读更直接客观、耗时短等优点，可为临床检测病原菌快速、精准选择抗生素治疗提供依据。

表4 临床革兰阴性菌荧光法与微量肉汤法药敏结果

革兰阴性菌	例数/株	美罗培南%		环丙沙星%		妥布霉素%		阿米卡星%		头孢他啶%		头孢噻肟%
		EA	CA	EA	CA	EA	CA	EA	CA	EA	CA	EA	CA
大肠埃希菌	15	93.33	93.33	93.33	83.70	92.85	92.85	100.00	100.00	100.00	100.00	92.85	93.33
鲍曼不动杆菌	14	100.00	100.00	100.00	100.00	92.85	92.85	100.00	92.85	92.85	92.85	100.00	100.00
奇异变形杆菌	14	92.85	97.75	93.00	93.50	93.00	93.00	100.00	100.00	93.75	93.70	93.75	100.00
阴沟肠杆菌	16	100.00	97.95	93.75	91.25	93.00	93.00	100.00	100.00	93.75	93.75	100.00
铜绿假单胞菌	16	93.75	100.00	93.75	91.25	96.70	96.70	100.00	93.80	90.00	90.00	93.75	97.85
总计	91	95.60	96.90	95.70	93.70	96.00	96.00	100.00	98.00	96.70	96.70	94.50	97.80

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