忍冬提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌生长曲线、细胞形态和生物膜形成能力的影响（四）
2.3忍冬不同部位提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌的MIC和MBC
金银花和忍冬叶提取液对A.acidoterrestris均有较强的抑制作用，但抑制效果随浓度的降低而减弱（表2）。当提取液浓度为3.91 mg/mL时，仍表现出抑制作用，培养液仍澄清透明。因此，金银花和忍冬叶提取液对A.acidoterrestris的MIC均为3.91 mg/mL。在MIC值的基础上，测定了金银花和忍冬叶提取液对A.acidoterrestris的MBC值。结果表明，金银花与忍冬叶提取液对A.acidoterrestris的杀菌效果相同，当提取液浓度为31.25 mg/mL时，仍无活菌存在，金银花和忍冬叶提取液对A.acidoterrestris的MBC值均为31.25 mg/mL。
表2忍冬不同部位提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌的MIC和MBC
2.4忍冬不同部位提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌生长曲线的影响
微生物生长过程中，菌液浓度往往与OD600 nm下的吸光度呈正相关，因此可通过测定A.acidoterrestris相应培养时间与A.acidoterrestris菌液吸光度之间的变化来判定A.acidoterrestris的生长状况。测定不同浓度的金银花和忍冬叶提取液对A.acidoterrestris生长曲线的影响以进一步探究其抑菌作用（图2）。对照组的A.acidoterrestris正常生长，迟缓期为2 h，随后进入对数期，在12 h时A.acidoterrestris菌液密度最高，其吸光度达到（1.301±0.032），随后进入生长稳定期。当花和叶抑菌浓度为1 MIC时，菌体生长被抑制，直至24 h时，菌体开始生长，吸光度分别为0.159±0.032和0.144±0.021，两者抑菌效果无显著性差异（P>0.05）。当浓度达到2 MIC时，A.acidoterrestris的生长明显被抑制，24 h内菌液的吸光度均无明显变化。随着提取液浓度继续增大到MBC时，A.acidoterrestris无生长迹象。结果表明，金银花和忍冬叶提取液对A.acidoterrestris的抑菌效果相同，并随着浓度的增大，抑菌效果更明显。
图2忍冬不同部位提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌生长曲线的影响
2.5忍冬不同部位提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌细胞形态的影响
对照组A.acidoterrestris呈现杆状，菌体形态完好，表面光滑，未观察到细胞破损或内容物溢出等现象（图3）。随着金银花和忍冬叶提取液浓度的增大，A.acidoterrestris的菌体形态发生不同程度的变化。当浓度为1 MIC时，A.acidoterrestris的菌体表面变得粗糙，出现褶皱和凹陷现象。浓度为2 MIC时，A.acidoterrestris的菌体损伤更明显，呈凹凸不平的无规则形态，细胞界限变得模糊，表面出现孔洞，细胞基质出现外泄现象。在4 MIC浓度下，A.acidoterrestris的菌体被严重破坏，内容物溶出，细胞膜几乎完全破裂，难以维持正常形态。Cai等使用绿原酸和肉桂酸处理A.acidoterrestris，研究发现绿原酸和肉桂酸对A.acidoterrestris的抑菌作用机制归因于对菌体细胞膜的破坏，导致细胞膜发生破裂，进而导致蛋白质和核酸的泄漏。Li等研究发现，对香豆酸对A.acidoterrestris的作用机制是由于对香豆酸的作用导致细胞内ATP减少，对香豆酸可以与DNA相互作用，干扰正常的细胞功能，A.acidoterrestris细胞膜完整性受损，细胞形态出现畸变。综上所述，忍冬提取液对A.acidoterrestris的抑制作用可能是忍冬中丰富的绿原酸、多酚和黄酮等活性成分严重破坏了A.acidoterrestris的细胞膜结构，致使菌体形态发生变化，细胞基质外泄，难以正常生长。
图3忍冬不同部位提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌细胞形态的影响
注：（a）：不同浓度金银花提取液对脂环酸芽孢杆菌细胞形态的影响；（b）：不同浓度忍冬叶提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌细胞形态的影响；A：Control，B：1 MIC，C：2 MIC，D：4 MIC。
2.6忍冬不同部位提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌生物膜形成能力的影响
如图4（a）所示，经忍冬不同部位提取液处理后，A.acidoterrestris的生物膜量显著低于对照组（P<0.05），且随着金银花和忍冬叶提取液浓度的增大，染色液OD590 nm值整体呈现逐渐降低的趋势，与之对应的96孔板颜色逐渐变浅（图4（b））。当提取液浓度为4 MIC时，OD590 nm值最小，其对应培养孔的颜色与AAM培养基颜色相近。金银花提取液对A.acidoterrestris的生物膜的形成有较大的影响，低浓度条件下可有效减少生物膜生成量，高浓度时可完全抑制生物膜的生成，且忍冬叶提取液对A.acidoterrestris的生物膜形成能力的影响与金银花提取液无显著性差异（P>0.05），这与其对A.acidoterrestris生长曲线的影响结果是相同的（图2）。细菌的生物膜形成能力代表着细菌处于适宜条件下通过分泌胞外多糖从而达到形成细菌菌落的能力，而生物膜形成能力越强的菌体表面越浑浊，吸光度越大，细胞膜形成能力明显降低，表明金银花和忍冬叶提取液能抑制生物膜的形成，对生物被膜具有清除作用。菌体生物被膜主要包括胞外多糖和蛋白质，忍冬提取液对A.acidoterrestris生物膜的抑制作用，可能是提取液中的绿原酸等生物活性成分影响了A.acidoterrestris分泌胞外多糖，菌体内蛋白质组分出现损失，从而使得OD值降低。
图4忍冬不同部位提取液对酸土脂环酸芽孢杆菌生物膜形成能力的影响
注：（a）：金银花和忍冬叶提取液处理后酸土脂环酸芽孢杆菌培养液染色后的吸光度；（b）：金银花和忍冬叶提取液处理后酸土脂环酸芽孢杆菌培养液染色后的图片。不同大写字母表示同一部位不同浓度间差异显著（P<0.05），不同小写字母表示不同部位同一浓度间差异显著（P<0.05）。
3.结论
忍冬叶和金银花中的总酚、总黄酮和绿原酸含量均显著高于忍冬藤（P<0.05）。三个部位提取液对A.acidoterrestris、S.agalactiae、L.monocytogenes、S.aureus、B.subtilis、E.coli和Salmonella均具有一定的抑制效果，且忍冬叶和金银花提取液的抑菌效果优于忍冬藤。此外，忍冬叶和金银花提取液对A.acidoterrestris的抑菌效果最明显，MIC值均为3.91 mg/mL，MBC值均为31.25 mg/mL，且抑制效果随提取液浓度的增加而增强。忍冬叶和金银花提取液能有效抑制A.acidoterrestris菌体生物膜的形成。扫描电镜结果显示，忍冬叶和金银花提取液处理后的A.acidoterrestris菌体形态发生畸变，胞内基质发生泄露。本研究为阐明忍冬抑制A.acidoterrestris的机制奠定了坚实基础，忍冬有望成为果汁生产中抑制A.acidoterrestris污染的新型高效抑菌剂。但细菌的生物被膜形成能力与营养条件、环境等多种因素有关，因此忍冬对A.acidoterrestris生物膜形成的影响机制还需进一步研究。
相关新闻推荐
1、恒河猴肺中阴沟肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性试验——摘要、材料和方法
3、基于ELISA和细菌生长曲线应用的结合定量检测肠炎沙门氏菌（二）