基于超微药粉琼脂稀释法检测9种致病菌对常用15种中药的敏感性（二）
2.2纸片法测定中药水提液对致病菌的抑菌圈大小
选取致病菌敏感性不同的3种中药（五倍子、地榆、石榴皮），按照中药高压水提液的制备方法制备药敏实验的药液，然后依据纸片法测定此3种药液对4株鳗鲡致病菌的抑菌圈大小，实验结果见表2。从表2中数据可知，不同浓度药液对4株鳗鲡致病菌的抑菌圈大小各不相同，随浓度的升高呈增大趋势。B01对3种药液高度敏感的最小浓度分别是五倍子125 mg/l、地榆＞1 000 mg/l、石榴皮500 mg/l；B09对3种药液高度敏感的最小浓度分别是五倍子500 mg/l、地榆500 mg/l、石榴皮500 mg/l；B14对3种药液高度敏感的最小浓度分别是五倍子250 mg/l、地榆＞1 000 mg/l、石榴皮＞1 000 mg/l；B15对3种药液高度敏感的最小浓度分别是五倍子250 mg/l、地榆250 mg/l、石榴皮＞1 000 mg/l。由此说明4株致病菌对五倍子均表现为高度敏感，B09、B15对地榆及B01、B09对石榴皮表现为高度敏感，B01、B14对地榆及B15对石榴皮显示为中度敏感，而B14对石榴皮表现为不敏感。
2.3平板二倍稀释法测定中药水提液对致病菌的抑菌效果
表2纸片法检测4株鳗鲡致病菌对3种中药水提液的敏感度（平均抑菌圈直径mm）
选取致病菌较敏感的8种中药（见表3），采用平板二倍稀释法进行药敏实验。从表3实验数据可知：平板二倍稀释法测定8种中药抑制9株致病菌的平均MIC值比超微药粉琼脂稀释法测定的结果均偏高，即灵敏度下降，但实验数据总体趋势相一致。
9株致病菌对五倍子仍然均呈现出高度敏感；对首乌藤除B19、B20为中度敏感外，其余7株菌均表现为高度敏感；对地榆高度敏感的菌株是B09、B15、B18、B20，比超微药粉琼脂稀释法测得结果少一株B19，降为中度敏感；对石榴皮低敏感和不敏感的菌株是B10、B14、B15、B18、B20，比超微药粉琼脂稀释法测得结果多了三株（B15、B18、B20）；对贯众低敏感和不敏感的菌株是B09、B14、B15、B20、B27，比超微药粉琼脂稀释法测得结果多了二株（B14、B15）；对大黄中度敏感的菌株是B01、B15，比超微药粉琼脂稀释法测得结果少了一株B10；对黄芩除了B01、B19表现低度敏感外，其余均为不敏感；对虎杖高度敏感的菌株是B01、B18，比超微药粉琼脂稀释法测得结果少了二株（B10、B14），降为中度敏感。
3讨论
本实验没有选择试管二倍稀释法测定致病菌对中药的敏感度，是因为中药粗提液含有大量色素，颜色深，且不同中药药液的颜色各不相同，会影响最终结果的观察判断，故在初期筛选抗菌中药的研究中不宜采用试管二倍稀释法。因此，我们选择药敏纸片法和平板二倍稀释法筛选抗菌中药，测定中药药液的抑菌效果，与本文建立的超微药粉琼脂稀释法进行比较，以确定该方法的可行性和可靠性。
表3平板二倍稀释法测定各种中药水提液的最低抑菌浓度MIC（mg/l）
3.1药敏纸片法与超微药粉琼脂稀释法的比较
针对9株致病菌从15种中药筛选出具有高效抑菌作用的药材。采用药敏纸片法一次试验需要制备81个琼脂平板；而采用超微药粉琼脂稀释法一次试验只需要45个琼脂平板。两者相比，筛选工作量显著减少，操作更快捷，实验材料费大大降低。
前期预实验结果显示，由于受纸片上药物含量的限制，低敏感度和不敏感的中药对致病菌均不产生抑菌圈，且考虑到实验操作量，故表2中只选择抑菌效果较好的3种中药（五倍子、地榆、石榴皮）和有代表性的4株致病菌进行比较实验。从表1和表2中的实验数据，采用超微药粉琼脂稀释法测得有效抑菌浓度低于纸片法，即灵敏度相应提高，然而4株致病菌对中药五倍子、地榆、石榴皮的分级敏感程度与纸片法检测结果一致。
3.2平板二倍稀释法与超微药粉琼脂稀释法的比较
平板二倍稀释法与纸片法所使用的药物都是液体，在做药敏实验之前同样都要通过耗时较长、操作较复杂的中药提取工序。而超微药粉琼脂稀释法，只需将中药药材进行超微粉碎处理即可，步骤简单。由于药材粉碎颗粒足够细，达到了5～10μm，保证药材中的有效成分在琼脂培养基中可以充分溶出，无需再考虑有效成分提取率高低对药敏结果的负面影响。
比较表1和表3的实验数据，9株致病菌对8种不同中药的敏感度显示，超微药粉琼脂稀释法测得平均最低抑菌浓度均低于平板二倍稀释法，灵敏度明显增加。虽然这两种方法在抑菌浓度上测得数据有差异，个别菌株的敏感度级别发生变化，但不同中药对某一株致病菌的抑制效应强弱是一致的。
超微药粉琼脂稀释法测定的中药MIC值均低于平板二倍稀释法，原因在于平板二倍稀释法使用的是中药超微粉的高压水提液，而超微药粉琼脂稀释法是直接使用中药超微粉；采用水煎煮、高压抽提、超声提取、微波提取或有机溶剂萃取等中药粗提方法，均无法将中药植物药材细胞内的有效成分完全溶出，且提取过程也会造成有效成分的部分降解失活，故降低了抑菌效果；而本法将中药超微粉直接添加入琼脂培养基，在进行抑菌药敏实验过程中，微米级颗粒的药粉一直存在于细菌培养基内，不断释放抗菌有效成分，可达到较高的抑菌浓度。故可避免由于中药粗提方法选择不当，造成有效物质提取率低，而容易在初步筛选时将高效的抗菌药材遗漏等问题。
综上所述，本文建立的抗菌中药植物药材的初步筛选方法——超微药粉琼脂稀释法具有操作简便、快捷、耗时短、处理量大（即每一个90 mm平皿可同时检测9～12株致病菌对药物的敏感度），实验成本低，以及药敏实验结果准确可靠等优点，是一种高效率的药敏实验方法，在实验研究中具有很好的应用价值，为开发和应用植物中药提供基础的参考数据。