碳青霉烯类耐药革兰阴性菌联合药敏试验方法学、流程、优缺点和结果判读（一）
1前言
碳青霉烯类抗菌药物包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等，是治疗多重耐药革兰阴性菌所致感染最有效的抗菌药物之一。随着该类药物在临床的广泛使用，碳青霉烯类耐药细菌（carbapenemresistant organisms，CRO）的检出率呈逐年上升趋势，其中以肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌为代表。CHINET中国细菌耐药监测网2021年监测结果显示，我国临床分离肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率分别为23.1%、23%和71.5%[1-2]。由于CRO通常还携带对其他抗菌药物耐药的基因，呈广泛耐药甚至全耐药的特征，使临床的抗感染治疗面临无药可用的困境，导致感染患者的高病死率。CRO感染治疗面临的困境急需实验室开展联合药敏试验[3-11]，多药联合治疗可延长抗菌药物的使用寿命[12]，体外联合药敏试验证实两药呈协同或相加作用的联合，能有效改善CRO感染患者的病死率。联合药敏试验可通过两药/多药组合分析不同药物之间的协同抗菌活性，在筛选针对CRO菌株所致感染的精准抗感染治疗方案中发挥重要作用。为规范碳青霉烯类耐药革兰阴性菌联合药敏试验及报告，上海市微生物学会微生物耐药防控专委会、CHINET中国细菌耐药监测网和上海市细菌真菌耐药监测网组织专家对上述问题进行了讨论，撰写了专家共识并对联合药敏试验方法和结果报告进行了推荐，以期对各医疗机构开展针对CRO菌株的联合药敏试验及报告提供帮助。
2 CRO的定义及耐药机制
碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbapenemresistantEnterobacterales）定义为满足以下任意一个条件[13]：①对亚胺培南、美罗培南、厄他培南或多利培南任何一种碳青霉烯类抗菌药物耐药者。对于天然对亚胺培南敏感性降低的细菌（如摩根菌属、变形杆菌属和普罗威登菌属等），需参考除亚胺培南外的其他碳青霉烯类抗菌药物的药敏结果；②产生碳青霉烯酶。碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌（carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA）和碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii，CRAB）定义为对亚胺培南、美罗培南或多利培南任何一种碳青霉烯类抗菌药物耐药者。产生碳青霉烯酶是肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药最主要的机制，包括A类丝氨酸碳青霉烯酶（以KPC酶为主）、B类金属β内酰胺酶（以NDM型金属酶为主）和D类丝氨酸碳青霉烯酶（以OXA-48型酶为主）。铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药的主要机制包括AmpC酶高表达合并外膜渗透屏障、外排泵高表达以及产生碳青霉烯酶（包括KPC型碳青霉烯酶和金属β内酰胺酶）等。鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药的主要机制是天然产生OXA-23、OXA-24或OXA-51型酶。
3开展联合药敏试验的时机
仅当药敏试验结果显示细菌对常规所有测试的抗菌药物均耐药，或临床医师有特殊治疗需求时，开展联合药敏试验筛选可能的多药联合治疗方案。开展联合药敏试验的时机参考图1。
图1联合药敏试验时机及结果报告流程
4联合药敏的方法及其局限性
当前临床微生物实验室常规采用的药敏试验方法包括肉汤微量稀释法、肉汤宏量稀释法、琼脂稀释法、E试验法、自动化药敏仪器和纸片扩散法。除纸片扩散法为定性检测方法外，其余均为定量检测方法。联合药敏试验方法包括肉汤微量稀释棋盘法、琼脂稀释棋盘法、纸条法（包括E试验条和MTS条）、纸片扩散法和联合杀菌曲线等[16-21]。肉汤微量稀释棋盘法和琼脂稀释棋盘法是联合药敏试验的标准参考方法，但该方法操作繁琐且基本为手工操作，导致常规实验室开展的可操作性差。因此，操作简单灵活的纸条法和纸片法不失为常规实验室联合药敏可选择的方法。
专家共识一：联合药敏试验是临床微生物室常规药敏试验的补充，仅对多重耐药菌如碳青霉烯类耐药革兰阴性菌或临床医师有特殊治疗需求的耐药菌株进行联合药敏试验，其他菌株不建议常规开展联合药敏试验。
专家共识二：联合药敏试验方法首选肉汤微量稀释棋盘法，若实验室无法开展肉汤微量稀释棋盘法，可以纸条法或纸片扩散法替代。但需注意的是，纸条法或纸片扩散法结果仅供参考，如需确认应采用肉汤微量稀释棋盘法。
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