国内新发病原牛疱疹病毒4型(BoHV-4)qPCR鉴定、分离及一步生长曲线测定（二）
1.3病料处理及qPCR鉴定
使用合适长度的拭子采集30份患有生殖道疱疹或繁殖障碍的荷斯坦奶牛生殖道拭子，将拭子样品冻融2～3次，样品液经10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，采用RT-PCR和qPCR检测BoHV-4、BoHV-1和BVDV。qPCR及RT-qPCR体系各组分如下:反应酶12.5μL，上、下游引物各0.4μL，探针0.2μL，ddH2O 6.5μL，模板0.4μL。加完样后盖紧管盖，混匀，低速瞬时离心，使反应液集中管底后放入qPCR仪中进行反应。
BoHV-1的qPCR反应程序:37℃孵育2 min;95℃预变性20 s，95℃变性10 s，60℃退火延伸30 s，共40个循环。BVDV的RT-qPCR反应程序:50℃反转录15 min，95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃退火延伸30 s，共40个循环。
1.4病毒分离
取1.3节中鉴定为BoHV-4阳性的病料1 mL，经过0.22μm孔径滤器过滤，滤液作为接种材料。接种前，弃去6孔细胞板中的培养液，加入PBS后润洗细胞3次。接种后37℃吸附2 h，每隔30 min轻轻摇晃铺有HeLa细胞的细胞板。吸附结束后补加细胞维持液。对照孔不接种。置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。每天观察是否出现细胞病变。盲传3代后取400μL细胞培养物，通过磁珠法提取试剂盒提取核酸，用qPCR鉴定BoHV-4、BoHV-1和BVDV。
1.5病毒感染细胞的间接免疫荧光鉴定
将gB基因片段连接至pET-32a(+)载体，构建重组质粒pET-32a-gB，测序正确后转化BL21工程菌原核表达BoHV-4的gB蛋白，纯化后免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体，3次免疫后效价达到1:409 600。取1.4节中的病毒液，接种于铺有HeLa细胞的6孔板中，每孔接种100μL，于37℃细胞培养箱中培养48 h。弃去上清液，每孔加入4%多聚甲醛固定液100μL，4℃固定10 min。将固定液吸出，PBS清洗3次后加入通透液0.5%Triton-100 100μL，室温通透5 min。PBS清洗3次后加入100μL 50 g·L-1 BSA溶液，室温封闭1 h。弃BSA，PBS冲洗3次后加入100μL 1:200稀释的BoHV-4 gB蛋白小鼠多克隆抗体，37℃孵育1～2 h。PBS冲洗后加入FITC标记羊抗小鼠荧光二抗，37℃孵育40 min，PBS清洗后于荧光显微镜下观察。
1.6病毒的透射电镜观察
感染后的细胞待出现细胞病变后弃培养液，加入电镜固定液，常温避光固定约5 min，用细胞刮沿同一方向轻轻刮下细胞，用巴氏吸管吸入离心管内，放入离心机，低速(≤3 000 r·min-1)离心3～5 min，得到绿豆大小细胞团。弃固定液后加入新的电镜固定液，吹散细胞团并重悬，4℃过夜固定，由南京农业大学作物遗传与种质创新利用全国重点实验室制样，再通过电子显微镜(HITACHI HT7700)观察并拍照。
1.7病毒的一步生长曲线测定
为明确病毒在细胞内的生长情况，将HeLa细胞提前传代后接种12孔板，待铺成单层细胞，以MOI为0.1的病毒量感染HeLa细胞，同时设置阴性对照。37℃孵育2 h后弃病毒液，用PBS清洗2～3次后加入含2%FBS的DMEM培养基，置于37℃细胞培养箱继续培养。分别于接毒后6、12、24、36、48和72 h收取细胞培养物，丹麦Biosense微生物生长动态监测系统通过测定每个时间点的TCID50来计算病毒滴度，绘制生长曲线。
1.8 BoHV-4的gB和TK基因序列扩增
以病毒DNA为模板，分别以gB-F/R和TK-F/R为引物，对病毒的gB和TK基因进行PCR扩增。扩增体系如下:2×Phanta Master Mix 25μL，上、下游引物各2μL，模板5μL，ddH2O补至50μL。PCR反应程序:95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸10 min。取PCR扩增产物进行10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR阳性产物后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
1.9 BoHV-4病毒gB和TK序列遗传进化分析
将gB和TK基因的序列用NCBI中的BLAST工具进行在线比对，使用MEGA 11软件，参照BoHV-4参考毒株DN599(GenBank登录号:JQ838062.1)、Movar 33/63(AB035516)以及NCBI上的其他分离株序列进行遗传进化分析，绘制分离株gB和TK基因的遗传进化树，并分析其进化规律。
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