快速药敏检测技术方法、原理、临床转化需求（一）
1.3显微自动聚焦技术与丹麦Biosense oCelloScope系统的技术融合
在传统稀释法药敏试验的基础上，显微自动聚焦技术通过高频显微拍摄（每小时进行动态监测），实时捕捉微生物在数量与形态上的变化，结合算法分析与数据库比对，2～8小时内即可报告药物的MIC值。目前，该技术已在阴性杆菌、葡萄球菌、肠球菌、链球菌等多种临床常见细菌的药敏检测中表现出良好性能，相关验证数据正在进一步完善中。
丹麦Biosense公司的微生物生长动态监测系统oCelloScope，正是基于“显微自动聚焦+动态成像分析”的技术原理，实现了药敏检测的快速化与精准化，且在技术细节上进行了多项创新优化。该系统集成高分辨率光学成像模块、恒温孵育模块与智能图像分析系统，可在药敏孵育过程中对微生物进行连续动态拍摄——每小时自动完成多次聚焦与成像，通过识别微生物形态（如细胞长度、宽度、团聚状态）与数量的细微变化，早期判断细菌是否被抗菌药物抑制。
相较于传统显微自动聚焦技术，oCelloScope系统在以下方面实现了关键技术突破：
超高灵敏度成像能力：采用定制化光学镜头与高稳定性光源，可清晰捕捉单个细菌细胞的形态变化——即使在孵育2小时内，细菌数量未出现显著增长时，也能通过细胞肿胀、分裂停滞、细胞膜完整性改变等细微形态特征，早期识别抗菌药物的抑制作用，进一步缩短检测时间；
全流程自动化与智能化：系统覆盖从样本加样、恒温孵育、动态成像到结果分析的全流程自动化操作，无需人工干预，有效减少人为操作误差；内置的微生物形态数据库涵盖临床常见致病菌（如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等），可通过AI算法自动比对不同药物浓度下的微生物生长曲线，快速计算并输出MIC值，降低对操作人员专业水平的要求；
广谱临床适用性：通过大量临床验证，该系统可适用于革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌等多种临床常见细菌的药敏检测，无需依赖专属药敏折点，可适配β内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类等临床常用抗菌药物，有效解决了RAST方法适用范围有限的问题；
临床标本直接检测能力：该系统支持对血培养阳性标本、尿液标本等临床样本的直接药敏检测，无需经过传统的纯培养步骤——例如，对血培养阳性标本的药敏检测可在4～6小时内完成，较传统方法（24～48小时）缩短20小时以上，为重症感染患者的紧急救治提供关键支持。
目前，oCelloScope系统已在多项临床研究中验证了其性能：针对肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等常见耐药菌的药敏检测，其结果与微量肉汤稀释法的基本一致性（EA）达到95%以上，分类一致性（CA）维持在85%～90%，且对碳青霉烯类耐药菌（CRE）的检测准确率显著优于传统方法[参考Biosense临床验证数据]。
二、基于荧光标记显示细胞活性的快速药敏技术
此类技术的核心原理是通过荧光物质标记微生物细胞的特定成分，利用荧光信号的变化反映细胞活性状态，进而判断抗菌药物的抑制效果。其显著优势在于，可在微生物未形成肉眼可见生长前，通过荧光信号放大微生物活性的早期差异，实现药敏结果的快速判读。
2.1三磷酸腺苷（ATP）生物发光法
ATP是所有活细胞的核心能量载体，微生物细胞内的ATP含量相对稳定；荧光素酶可催化荧光素发生氧化反应并释放生物光，而该反应的启动必须以ATP为底物——当荧光素浓度足量时，反应产生的荧光强度与体系内游离ATP的含量呈正相关[13]。基于这一特性，ATP生物发光法可通过检测荧光强度间接反映微生物活性，进而实现药敏检测。
国外学者最早将该技术应用于快速药敏检测，2小时内即可获得MIC值，检测限可达10³CFU/mL，但该方法需先对微生物进行裂解以提取ATP，操作步骤较为复杂[14]。国内向杰等学者对该技术进行优化，省去ATP提取步骤，根据抗菌药物作用机制的差异（将药物分为生长依赖型/抑菌剂、致死依赖型/杀菌剂），设计不同的结果判断标准。优化后的方法与微量肉汤稀释法的检测结果对比显示，基本一致性（EA）达到90%，分类一致性（CA）为80%～84%，检测周期从传统的16～24小时缩短至5～6小时[15]。
此外，刘君等学者将该技术拓展至结核分枝杆菌药敏检测领域，通过优化孵育条件与检测参数，可在（6.6±2.1）天内获得药敏结果，与传统罗氏培养法的符合率达到95.2%，显著缩短了结核分枝杆菌药敏检测的周期，为结核病的精准治疗提供了支持[16]。
2.2荧光细胞染色法
该技术利用荧光染料的细胞膜渗透性差异，区分细菌的活性状态：荧光染料SYBR GreenⅠ可穿透完整的细胞膜进入活细胞内，使活细胞呈现绿色荧光；碘化丙啶则无法穿透完整细胞膜，仅能进入细胞膜受损的死亡细胞或濒死细胞，使这类细胞呈现红色荧光。通过荧光显微镜或荧光分析仪检测体系内绿/红荧光的比值，即可量化细菌种群的存活状态，进而判断抗菌药物的抑制效果。
Zhang等学者与Feng等学者分别基于该原理开发快速药敏检测方法，均实现了30～60分钟内获得快生长病原微生物药敏结果的突破[1718]，为临床紧急感染救治提供了高效解决方案。
除上述双色荧光染色法外，刃天青染色法也是常用技术路径。刃天青作为一种氧化还原指示剂，在氧化状态下呈蓝色，在还原状态下会不可逆地转化为粉红色荧光产物试卤灵。细菌在生长繁殖过程中，细胞内处于还原环境，摄入细胞内的刃天青会被还原为试卤灵并释放至培养基中，导致培养基颜色从蓝色变为粉红色，且荧光强度与活性细胞数量呈正相关。基于这一特性，该方法最快可在2小时内获得细菌药敏结果[19]。但该技术存在一定局限性：刃天青无法被铜绿假单胞菌等非发酵革兰阴性杆菌代谢，因此不适用于这类细菌的药敏检测，临床应用范围受限。为拓展应用场景，研究者开发基于刃天青还原法的微流体芯片技术，用于尿液中分离细菌的药敏检测，6小时内可获得MIC值[20]。
2.3 qPCR检测细菌16S rDNA
微生物与抗菌药物共同孵育过程中，细胞代谢变化具有时间差异性：RNA与DNA的变化会在2小时内显现，而蛋白质的变化则需4小时后才出现。考虑到RNA在体外易降解，难以保证检测稳定性，使用通用引物检测细菌16S rDNA（细菌核糖体RNA的编码基因，具有物种特异性与高度保守性）更具临床应用前景。
中国科学院武汉病毒研究所罗俊博士团队基于这一思路，利用qPCR技术检测与抗菌药物共同孵育后的细菌16S rDNA，通过分析核酸拷贝数的变化判断细菌生长抑制情况。在对36株铜绿假单胞菌和28株金黄色葡萄球菌的药敏检测中，该方法与标准微量肉汤稀释法的结果一致性分别达到97.22%和96.43%[21]，验证了技术准确性。Xie等学者也通过类似技术路径，在孵育2小时后成功检测出鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌对不同抗菌药物的敏感性[22]，进一步证明了该技术的可行性。
三、基于细胞代谢状态/产物检测的快速药敏技术
此类技术的核心逻辑是通过捕捉微生物代谢过程中的产物变化（如挥发性有机化合物、生物大分子合成情况），间接反映微生物的活性状态，进而判断抗菌药物的抑制效果。其关键优势在于利用高灵敏度检测技术，放大代谢信号的早期差异，实现药敏结果的快速判读。
3.1代谢产物显色法
细菌在生长繁殖过程中会释放多种挥发性有机化合物，包括胺类、醛类、芳香族化合物、酮类、酯类等。基于这一特性，研究者设计了带有化学小分子感受器的药敏检测孔——这些感受器可与细菌释放的挥发性有机化合物发生特异性反应，导致颜色变化。检测仪器每10分钟对感受器颜色进行一次扫描，通过对比不同药物浓度下感受器的颜色变化，可在早期区分有细菌生长与无细菌生长的药敏孔，进而计算得出药物的MIC值。
Antonelli等学者基于该技术搭建检测平台，直接对革兰阴性杆菌血培养肉汤进行药敏检测，平均获得药敏结果的时间仅为4.6小时，较传统方法缩短24～48小时[23]。该平台还具有两大优势：一是血培养显示阳性后16小时内的肉汤标本均可使用，无需严格控制标本采集时间；二是可检测16～22种抗菌药物，包括头孢他啶/阿维巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦、美罗培南/韦博巴坦等新型抗菌药物，为多重耐药菌感染的精准治疗提供了关键支持。
3.2拉曼光谱技术
拉曼散射是一种特殊的光散射现象：当光穿过介质时，极少数光子会与介质分子发生能量交换，导致散射光的频率发生改变。通过光谱仪对散射光进行色散处理，并由探测器采集信号，可获得拉曼光谱。分析拉曼光谱中峰的位置、漂移、宽度、强度等信息，可实现对样品的定性与定量分析。目前，拉曼光谱技术已广泛应用于生物化学、安检安防、考古探测等多个领域。
在药敏检测领域，病原菌细胞内的核酸、蛋白质、脂质等生物大分子均可通过拉曼光谱呈现特征峰，且峰强度与分子在细胞内的含量呈正相关。当微生物受到抗菌药物作用时，细胞内生物大分子的组成与代谢产物会发生改变，这些变化可通过拉曼光谱被精准捕捉，进而判断抗菌药物的效果——由于这类方法无需添加外源标记物，仅依赖微生物自身的光谱信号，因此被归为拉曼药敏技术的非标记检测法[24]。
除非标记法外，标记法拉曼光谱技术是当前研究热点，其中以重水（D₂O）标记法最为成熟。该方法将D₂O掺入药敏培养基中，使其作为代谢标记物参与细菌的生物合成过程：重水中的氘原子会整合到细菌合成的蛋白质、脂质等生物大分子中，在拉曼光谱的“生物静默区”（该区域无其他生物分子的光谱信号干扰）形成明显的CD特征峰，且峰强度与细菌的代谢活性呈正相关[25]。
该技术的通用检测步骤为：首先将细菌在含不同浓度抗菌药物的培养基中孵育1～2小时；随后向培养基中加入浓度为30%～100%的D₂O，继续孵育30分钟左右；最后通过拉曼光谱仪检测CD峰强度，根据峰强度判断细菌的代谢活性，进而筛选出有效抗菌药物[26]。
该技术具有三大核心优势：一是无需对微生物进行培养、染色或其他标记处理，可直接检测临床标本；二是检测速度快，对尿液标本的药敏检测仅需2.5小时，远快于传统方法（48小时）；三是适用于无法培养或难培养的微生物（如某些厌氧菌、苛养菌）的药敏检测，为特殊感染性疾病的治疗提供了新的技术路径[27]。
相关新闻推荐
2、不同包装方式下清蒸大黄鱼贮藏过程中PH值、菌落总数、菌群等的变化情况（一）
3、快速药敏检测方法、发展现状|拉曼光谱在RAST领域中的应用（一）