基于体外重组鸡传染性贫血病毒生长曲线研究复制效率（一）
摘要：为研制新型鸡传染性贫血（CIA）高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒（CIAV）感染问题，试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统，以血清4型禽腺病毒（FAdV-4）为载体，构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证，通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示：该重组病毒构建成功，能有效表达CIAV VP1蛋白，命名为rFAdV-4-CIAV-VP1，且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。
鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）感染主要引起以雏鸡再生障碍性贫血与全身性淋巴组织萎缩为特征的免疫抑制性疾病，同时导致机体对其他病原易感性增加以及对疫苗免疫应答降低。尽管CIA商品化弱毒活疫苗在种鸡中使用广泛，国内商品鸡群中CIAV与其他病毒的混合感染较为普遍，严重制约了国内养鸡业的健康发展。CIA商品化弱毒活疫苗不适用于免疫雏鸡，对雏鸡存在潜在的感染致病风险。由于在细胞和鸡胚上均很难获得高滴度的CIAV，迄今为止，国内外市场上尚无商品化的CIAV灭活疫苗的报道。有研究报道，将重组杆状病毒在昆虫细胞中共同表达VP1和VP2蛋白的细胞裂解物去免疫鸡群，可以有效刺激鸡群产生中和抗体，且该抗体可以保护子代鸡免受CIAV感染。然而，目前同样缺少基于重组杆状病毒的CIA亚单位商品化疫苗。因此，研发新型CIA疫苗对高效免疫防控CIA及其他病毒病至关重要。
血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4）感染主要导致肝炎-心包积液综合征。自从1987年在巴基斯坦报道以来，FAdV-4逐渐向周边国家扩散。2015年以来，国内鸡群大面积暴发高致病性FAdV-4，鸡群感染死亡率高达30%~80%，对国内养鸡业造成了巨大的经济损失。值得注意的是，本课题组前期研究发现CIAV感染可大大降低鸡群对FAdV-4疫苗的免疫应答。最近，本课题组利用CRISPR-Cas9技术编辑FAdV-4的fiber-2基因，分别创制了EGFP与Fiber-2融合，EGFP代替Fiber-2以及Fiber-2部分缺失的重组FAdV-4基因工程弱毒候选疫苗，证明了fiber-2基因的可编辑性以及FAdV-4作为载体开发表达外源基因的重组基因工程疫苗的可行性。为研制新型CIA高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的CIAV感染问题，本试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统，将FAdV-4中的fiber-2基因替换为CIAV的保护性抗原基因VP1，成功获得了表达CIAV的VP1蛋白的新型重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1，从而为探索有效防控CIAV和FAdV-4感染的新技术奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1细胞、病毒、抗体和质粒
鸡肝癌细胞系（LMH）来源于美国菌种保藏中心（ATCC），在含有10%胎牛血清（购自Lonsera公司）的Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12（购自Gibco公司）培养基中培养，37℃、5%CO2。所用的CIAV毒株T1P6和FAdV-4毒株SD2015均由本实验室分离、保存。表达绿荧光蛋白（EGFP）的重组FA4-EGFP由本实验室构建和保存。抗CIAV VP1蛋白的单克隆抗体2E3，抗FAdV-4 Hexon蛋白的单克隆抗体1B5，抗FAdV-4 Fiber-2的单克隆抗体1C9，抗FAdV-4的Fiber-1蛋白的单克隆抗体3B5和抗FAdV-4的多克隆抗体鸡血清均由本实验室制备、保存。携带红色荧光蛋白（RFP）表达盒的质粒pMD19-HAL-LoxP-RFP-LoxP-HAR和表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre均由本实验室构建和保存。
1.1.2主要试剂及仪器
主要试剂：2×Taq Master Mix、Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶、DL5000 DNA Marker、核酸胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒和一步克隆法试剂盒（CloneExpressTM II One Step Cloning Kit）均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DNA Super Marker、RIPA裂解液（强）和ECL超敏发光液均购自康为世纪生物科技有限公司；转染试剂Mirus购自MIRUS公司；Opti-MEM培养基和蛋白Marker均购自赛默飞世尔科技有限公司；蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自苏州新赛美公司；GAPDH单抗购自武汉艾博抗有限公司；羊抗鼠IgG-HRP购自Jackson Immuno Research公司；羊抗鼠IgG-FITC和羊抗鸡IgG-FITC均购自KPL公司。
构建重组病毒策略见图1：
主要仪器：ETC811型PCR扩增仪购自苏州东胜兴业科学仪器有限公司；DK-8D型37℃恒温水浴锅购自上海精宏实验设备有限公司；BB15型隔水式电热恒温培养箱购自赛默飞世尔科技有限公司；MQL-61R型恒温摇床培养箱购自上海旻泉仪器有限公司；5804R型低温超速离心机购自德国Eppendorf公司；Tanon 2500型凝胶成像系统与Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统均购自TANON公司；SW-CJ-2F型医用净化工作台购自苏州安泰空气技术公司；Ti2-U型倒置荧光显微镜购自日本尼康公司。
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