不同霉变时期肉豆蔻饮片需氧菌、霉菌、酵母菌菌落总数统计（一）
中药材的品质关系着中成药的质量和临床用药安全。近日，国家药典委员会发文道药品微生物检查是药品安全性控制的重要质控项目。世界卫生组织、欧洲药典、日本药典和美国药典均对天然药制定了微生物检查方法和限度标准，并作为对这类药物的安全质控项目，如：对直接服用或炮制处理过的中药材，需氧菌总数为105cfu·g-1，霉菌和酵母菌总数为103-104cfu·g-1；需煎煮的中药材需氧菌总数106-107cfu·g-1，霉菌和酵母菌总数104-105cfu·g-1。而我国关于中药饮片微生物限度的检查和限度标准的研究相对薄弱。
肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）的干燥种仁，又名咖拘勒、豆蔻、肉果、顶头肉等，主产于马来西亚、印度尼西亚、斯里兰卡等国，我国广东、台湾、云南等地有引种栽培。其整体呈卵圆形或椭圆形，表面灰棕色或灰黄色。质坚，断面显棕黄色相杂的大理石花纹，富油性。气香浓烈，味辛。肉豆蔻味辛、温，具有温中行气、涩肠止泻的功效。近代药理学研究表明肉豆蔻挥发油可促进缺血再灌注损伤心肌的恢复，有心肌保护作用，且对行为绝望抑郁小鼠有明显抗抑郁作用等。肉豆蔻中丁香酚类成分为其止泻主要成分，肉豆蔻木脂素具有明显抗炎作用，除此之外肉豆蔻亦有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等药理作用。
肉豆蔻的主要成分为挥发油和脂肪油等，营养成分丰富，极易发生霉变，是2015年版《中国药典》规定检测黄曲霉毒素限量的十九种中药之一。其在储藏过程中受到空气中霉菌孢子的污染，在适当的温度、湿度下即萌发为菌丝，分泌酵素，溶蚀药材的内部组织，使之腐坏变质，失去或降低药效，甚至产生毒素危害患者的生命安全。但是，在实验中发现肉豆蔻在不切开的情况下很难判断其是否霉变。
图1肉豆蔻不同霉变时期样品（a：J0样品；b：J6样品；c：J13样品）
有文献报道，肉豆蔻挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、沙门氏菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌共6种细菌及黄曲霉、黑曲霉等6种真菌均有抑制作用，且对细菌的抑菌活性比对真菌的抑菌活性强。
本文对极易霉变又具有抑菌作用的肉豆蔻饮片进行微生物计数方法适应性验证，并考察其在不同霉变时期需氧菌、霉菌、酵母菌菌落总数，以期为中药饮品微生物限度检查法提供相关理论基础。
1材料
1.1样品
肉豆蔻药材购自安国市兴华中药材有限公司，经北京中医药大学中药学院中药鉴定系闫永红教授依性状鉴定为肉豆蔻科植物肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）的干燥种仁。将无霉变的肉豆蔻饮片置恒温恒湿箱内（温度30℃，湿度95%）加速39天，每三天取一次样，共得到14批不同霉变程度样品。霉变不同时期样品（图1（a，b，c））。
1.2培养基及试剂
胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂对照培养基、沙氏葡萄糖琼脂对照培养基、聚山梨酯80均购自北京三药科技开发公司。
1.3菌种
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003第4代]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501第4代]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104第4代]、黑曲霉[CMCC（F）98003第4代]、白色念珠菌[CMCC（F）98001第4代]均为定量工作菌株，购自于北京三药科技开发公司。
1.4仪器
SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司，No：100253），MJ-70-1霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，201309）。
2方法与结果
参照《中国药典》2015年版第四部非无菌产品微生物限度检查通则1105：微生物计数法建立肉豆蔻饮片微生物计数方法。
2.1菌液制备
使用前将未开启的西林瓶平衡至室温，将1.1 mL无菌生理盐水加入西林瓶中，盖上瓶盖，静置约5-10 s，无菌吸管反复吹吸10次以上使其完全溶解。吸取1 mL已完全溶解的菌液加入9 mL无菌生理盐水中，混匀，逐级进行10倍稀释，最终使其含菌数量约500-1000 cfu·mL-1。
2.2供试液的制备
将肉豆蔻饮片置于用酒精棉球擦拭过的万能粉碎机中，粉碎，用灭菌的药匙将肉豆蔻粉末移至灭菌自封袋中备用。取10 g于灭菌研钵中，加入100 mL含0.1 mL聚山梨酯80的无菌生理盐水，迅速研磨使其溶解，制成1∶10供试液。依次制作1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000稀释液。
2.3培养基适用性试验
2.3.1需氧菌培养基适用性试验
分别移取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌液1 mL（含菌量50-100 cfu）至灭菌平皿中，分别倾倒胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂对照培养基15 mL，待其凝固后，倒置于恒温培养箱中30-35℃培养48 h。每个菌种每种类型培养基各做3个平行。测定菌落数。
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小与应与对照培养基上的菌落一致。结果（表1，图2），被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数均在0.5-2范围内。被检固体培养基上菌落形态大小与比值对照培养基上的菌落一致。
表1需氧菌培养基适用性试验结果
表2黑曲霉、白色念珠菌培养基适用性试验结果