高产纤维素酶枯草芽胞杆菌生长曲线、产蛋白酶及α-淀粉酶能力及药物敏感性研究（一）
摘要： 旨在筛选潜在高产纤维素酶的益生菌并探究其益生作用以期用于生产实践。从绵羊肠道内容物中，利用羧甲基纤维素钠（CMC-Na）平板筛选产纤维素酶菌株，测定其纤维素酶活性，筛选出目标菌株；采用形态学分析、生化试验和16S rDNA序列分析对目标菌株进行鉴定；进一步探究其生长曲线、产蛋白酶及α-淀粉酶能力、抑制病原菌能力、耐酸耐胆盐能力、药物敏感性和宿主安全性。结果：从样品中筛选获得8株产纤维素酶菌株，根据透明圈和菌落直径比值以及纤维素酶活性筛选获得产纤维素能力最强的菌株ECL1.2，其羧甲基纤维素酶活性为18.61 U/mL，经鉴定为枯草芽胞杆菌；ECL1.2在培养12 h后进入对数生长期，在培养26 h时进入稳定期；其蛋白酶和α-淀粉酶活力分别为2.08 U/mL和19.7 U/mL；可抑制大肠杆菌、肠炎沙门菌和金黄色葡萄球菌的生长；在pH值为2～7培养4 h及胆盐浓度为0.1%～0.3%培养8 h条件下存活率大于60%，具有一定耐酸耐胆盐性；除对林可霉素低敏、对庆大霉素中敏外，对青霉素、头孢唑啉、克拉霉素、诺氟沙星、万古霉素、利福平极其敏感；对小鼠器官和肠道无危害，并能提高小鼠日增重和采食量。综上，枯草芽胞杆菌ECL1.2可作为潜在益生菌。
1 引言
纤维素是一种广泛存在的可再生生物资源，主要存在于植物和谷物中。使用纤维素降解酶利用纤维素资源是当前的研究热点，其对于工业和农业经济的发展有极大的价值1。分泌高效降解组合酶菌株的选育是利用纤维素资源的关键，直接从自然环境中筛选菌株具有安全可靠性2。目前，在畜牧禽畜养殖行业，益生菌发酵饲料和发酵中药等被广泛用来提高饲料利用率、预防动物疾病、提高生产性能、增强动物机体免疫和改善养殖环境等3−7。益生菌发酵过程中产生的纤维素胞外酶可以与底物作用，使饲料营养成分和中药有效成分大量释放，所以产纤维素酶能力的大小是进行发酵菌株筛选的主要指标。芽胞杆菌具有高产纤维素酶的能力，能够在低pH值下存活，次级代谢产物在宿主体内发挥益生作用，发酵产品在室温下耐储存等优势，因此被认为是最理想的微生物添加剂8−9。
本试验从绵羊肠道中分离得到8株菌，并从中筛选出一株高产纤维素酶的芽胞杆菌菌株，且对其产蛋白酶和α-淀粉酶能力进行了检测，研究了其抑制病原菌和耐酸耐胆盐能力和安全性，为筛选有效利用纤维素资源的益生菌奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验样品取自10月龄健康绵羊的盲肠和结肠内容物，液氮速冻后-80℃保存；40只4周龄健康雌性昆明小鼠购于河南实验动物中心。
CMC-Na固体培养基：CMC-Na 5 g、酵母提取物2 g、K₂HPO₄ 1 g、琼脂20 g，去离子水定容至1 L；LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g、氯化钠10 g去离子水定容至1 L（固体培养基需再添加20 g琼脂）。琼脂、蛋白胨、酵母提取物均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、可溶性淀粉、干酪素、磷酸氢二钾等均购自国药集团化学试剂有限公司；福林酚购于北京索莱宝科技有限公司；刚果红、复红染液购自郑州安图生物有限公司；3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂、CMC-Na、牛胆盐、枯草芽胞杆菌生化鉴定管购自青岛海博生物有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；药敏纸片购自杭州微生物有限公司。
1.2 高产纤维素酶菌株的筛选
取采集的肠道内容物样本10 g，加入装有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，震荡混匀，85℃水浴10 min，倍比梯度稀释，吸取10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶稀释液100 μL均匀涂布于CMC-Na平板上，37℃培养24 h后选取单菌落纯化2代。将分离菌株点种于CMC-Na平板上，做3个重复，用超纯水做对照点，37℃培养24 h，刚果红染色法染色后，观察菌落周围的透明圆，测量透明圆直径（H）与菌落直径（C）的比值。
将分离菌株接种至LB液体培养基，37℃培养36 h，离心取得上清液即为菌株的粗酶液。采用董雪丽10的DNS方法测定羧甲基纤维素酶（CMC酶）活力。酶活定义：1 mL液体酶在50℃，每分钟水解CMC-Na底物，产生相当于1 μg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活单位（U/mL）。筛选出透明圆直径与菌落直径的比值最大以及CMC酶活性最高的菌株作为目标菌株。
1.3 高产纤维素酶菌株鉴定
观察目标菌株在LB固体培养基上的菌落形态并进行革兰染色镜检，进行菌株形态学观察。参照《伯杰细菌鉴定手册》，采用微量生化鉴定管进行菌株生化特征分析。提取菌株的DNA，用27F/1492R通用引物对（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 1492R: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′）进行16S rDNA片段扩增11。由擎科公司进行测序，采用邻接法构建系统进化树。
1.4 生长曲线的建立
采用倍比稀释法用LB平板测定目标菌株在0～46 h的活菌数，每隔2 h进行计数。以培养时间为横坐标、活菌数量为纵坐标，绘制生长曲线。