白马耳组织成纤维细胞体外培养、冷冻前及复苏后存活率、生长曲线绘制（一）
摘要:本研究以内蒙古乌珠穆沁白马(Equus caballus)雄性和雌性为实验材料，利用组织块贴壁培养法进行耳组织成纤维细胞原代建系，研究耳组织来源的细胞贴壁率、冷冻前及复苏后存活率、生长曲线，进一步绘制乌珠穆沁白马成纤维细胞核型图。实验结果显示，雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞经组织贴壁法建系培养，生长为典型的成纤维细胞形态，并呈现“S”型生长曲线特征;细胞冷冻前后存活率存在显著差异，但仍具有较好的耐受冷冻性;根据染色体核型分析，雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞染色体条数为2n=64，其中31对常染色体，1对性染色体。本研究成功建立了雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞系，并且得到可稳定培养、具有良好遗传学特性的细胞系，为后续的相关深入研究奠定了基础。
乌珠穆沁白马(Equus caballus)，蒙古名为乌珠穆沁查干阿都，是蒙古马中的优良品系，主要繁殖于内蒙古锡林郭勒盟西乌珠穆沁旗草原上。西乌珠穆沁草原是具有代表性的中国温带典型草原，总面积22960km2，是唯一汇集内蒙古九大类型草原的地区，也是中国北方草原最华丽、最壮美的地段，素有“天堂草原”之称。
我国对于乌珠穆沁白马的研究主要对不同年龄段的体高、体长、体重等体尺性状和非遗传因素、毛色特征、肉品质三方面进行了研究(敖敏2019)。除此之外，对乌珠穆沁白马马肉的营养成分测定和奶制品的营养成分的测定、分析以及与其他品种的比较分析(旭仁其木格2018，赵雪妮2021)。目前大量的马种资源处于数量下降、濒危或濒临灭绝状态，同时，目前是马种资源的保种和向非役用转型的关键时期(韩国才2014)，而细胞建系是物种遗传资源保护的重要途径，可为未来深入研究奠定基础。
本研究利用乌珠穆沁白马雄性和雌性耳组织成纤维细胞体外培养建立乌珠穆沁白马体细胞系，在此基础上对建成的体细胞系进行形态、贴壁率、冻存率、生长速度、核型等生物学特性分析，为其保护和开发利用提供参考。
1材料与方法
1.1实验材料
取雌(32#耳号14798)和雄(18#耳号14250)各一匹乌珠穆沁白马的耳部组织(材料采集是在不影响动物个体健康状况的情况下进行的，符合动物伦理)用75%的酒精消毒，装入含有青霉素-链霉素双抗的无菌生理盐水的50ml离心管内，带回实验室。再用75%的酒精再次消毒组织块，然后浸泡在无菌生理盐水中用PBS清洗3次，按照组织贴壁培养方法进行无菌接种培养(刘建等2018)。
1.2实验方法
1.2.1乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞原代培养及传代纯化培养
将生理盐水中保存的乌珠穆沁白马耳组织块置于30mm培养皿中用75%的酒精中浸泡30s，再用DPBS缓冲液清洗5次。在30mm培养皿中用眼科镊镊夹住组织块，将其剪成0.5~1mm3的小组织块，然后均匀地铺在T25培养瓶(康宁)中，倒置培养瓶并加入含有1%青霉素-链霉素双抗和10%特级胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)的MEM-Alpha培养液(gibco赛默飞)5ml，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，6~8h后缓慢将T25培养瓶翻转进行原代建系培养(穆瑶等2019)。
当细胞培养3~4d后，培养液变黄时需要更换新的培养液继续培养。当原代细胞培养生长至汇合度大于80%时，弃掉培养液，加入2ml DPBS轻轻晃动培养瓶冲洗细胞后弃掉废液，再加入2ml胰蛋白酶消化液在培养箱中静置消化细胞2~3min，直至在显微镜下观察细胞形态变成圆形或呈漂浮状态时，立即加入4ml已预热的培养液终止消化，反复吹打细胞使贴壁细胞脱落，得到单细胞悬液。由原代细胞直接进行传代时单细胞悬液中有较多组织块，需用过滤器将组织块过滤掉。将单细胞悬液1300 r/min离心3min后弃掉上清，收集细胞沉淀。再加入3ml预热培养液重悬细胞，将细胞按传代比例接种于T25培养瓶中，并用培养液补充至每瓶5ml，置于37℃5%CO2培养箱培养24h，观察细胞生长情况并拍照记录。
1.2.2乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞支原体检测
本实验使用BI-20-70020支原体检测试剂盒进行检测。在细胞生长状态良好时，取1 ml细胞培养液上清液200r/min离心3~5min收集上清液。将上清液13000r/min离心10 min收集沉淀。用50μl缓冲液重悬沉淀并充分混匀，于95℃干浴器上加热3min，得到检测样本。按照说明书配制PCR体系，包括检测样本(H2O29μl;反应混合物10μl;检测样本5μl;内控DNA模板1μl;内控引物混合物5μl)、阴性对照(H2O29μl;反应混合物10μl;H2O5μl;内控DNA模板1μl;内控引物混合物5μl)、阳性对照(H2O33μl;反应混合物10μl;内控DNA模板1μl;内控引物混合物5μl;阳性对照DNA模板1μl)。使用40μl矿物油覆盖反应物，防止蒸发。设置PCR反应参数:预变性94℃30s;变性94℃30s，退火60℃120s，延伸72℃60s，35个循环;循环结束后变性94℃30s，退火60℃120s，延伸72℃5min;反应结束后4℃保存。
使用2%琼脂糖凝胶电泳对上述PCR产物进行检测分析，使用凝胶成像仪拍照对比检测样本、阳性对照、阴性对照条带，确定检测样本是否存在支原体污染。支原体检测阳性模板为357bp和270bp两条带，其中270bp为支原体污染后显示的条带，支原体检测阴性模板条带为357bp，如出现样品出现270bp条带，则认为存在支原体污染。
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