白马耳组织成纤维细胞体外培养、冷冻前及复苏后存活率、生长曲线绘制（三）
2.3乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞冻存前及复苏后存活率对比
冻存前后在显微镜下计数，死细胞呈蓝色，活细胞呈透明(图4)，由于视野有限，仅挑选具有代表性的图片于文章中，并非全部图片。乌珠穆沁白马耳组织不同代次成纤维细胞在冷冻保存前细胞存活率差别很小，存活率均达到98%以上，没有显著性差异;随着细胞冷冻保存时间的延长，细胞的存活率逐渐下降，复苏后细胞的存活率明显低于冻存前，存活率在80%左右。但雌性乌珠穆沁白马耳组织P9细胞复苏后的存活率仍能达到90%以上(图5)。
每组重复3次;、代表差异显著(P<0.01、P<0.05)。
2.4乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞的不同代次生长曲线对比
乌珠穆沁白马细胞倍增时间随着培养代次的增加而增加，而倍增次数则随培养代次的增加而减少(表1)，说明随着培养代次的增加，细胞增殖速度下降，活力降低。雄性乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞培养过程中细胞生长曲线呈典型的“S”型(图6a)，低代次细胞增殖速度较培养高代次细胞快，在培养6d或7d时细胞增殖数目达到最大值。雌性乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞在P3~P6时细胞生长曲线呈典型的“S”型(图6 b)，生长速度最快，P9时细胞生长曲线走势平缓，生长活力没有明显的变化。
2.5乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞不同代次及不同时间的贴壁率对比
乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞的贴壁率随着培养时间的延长逐渐增加，6 h和12 h贴壁率均在较低的水平，24 h后贴壁率快速上升，大部分保持在90%左右(图7)。
2.6乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞染色体核型
使用显微镜以及遗传工作站拍照测量及排列雄性和雌性乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞染色体，并统计成纤维细胞核型，从而判断成纤维细胞遗传的稳定性。体外培养的雄性和雌性乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞染色体条数均为2n=64，其中，31对常染色体，1对性染色体(图8)。本实验选取的雄性、雌性乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞在体外培养时生长状态良好且维持了细胞的遗传信息稳定性。
3讨论
本研究成功建立了雄性和雌性乌珠穆沁白马的耳组织成纤维细胞系，并进行了相关的生物学特性分析，以检测细胞系的生长状况、细胞活力及其遗传稳定性，包括细胞贴壁率的测定、细胞生长曲线的绘制、细胞冷冻前及复苏后存活率的测定、细胞染色体核型的分析、细胞系支原体污染的检测，为后续实验提供可靠的数据资料及稳定的实验材料。
细胞培养过程中，雌性和雄性乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞的形态及生长状态略有差别，低代次时，雌性耳组织成纤维细胞生长形态及时间等各方面优于雄性耳组织成纤维细胞，细胞贴壁率整体呈现贴壁时间长，短时间内贴壁率与其他物种细胞相比较低。研究显示，狍狍(Capreolus gray)(郭晓楠2021)以及驯鹿(Rangifer tarandus)(王丹妮2021)的耳组织细胞在6~12h内迅速贴壁，而本实验中乌珠穆沁白马耳组织细胞的贴壁时间较长，可能是与细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子数量有关，但培养24h后乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞的贴壁率与其他物种无显著差异。雌性乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞低代次贴壁所需时间较长，随着代次的增加，贴壁所需时间减少，说明细胞生长趋于稳定且状态良好；雄性耳组织成纤维细胞随着细胞培养代次的增加，细胞贴壁率稳定所需时间也逐渐增加，在较低培养代次时细胞的贴壁率稳定性最强。乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞的生长曲线整体呈典型的"S"型，其中雌性成纤维细胞在P3时最大增殖细胞数量为46.38×10⁴个。对驯鹿耳组织成纤维细胞进行原代细胞建系培养并进行生物学特性分析，通过对生长曲线的测定发现，P45的最大增殖细胞数量为37.1×10⁴个(王丹妮2021)；对兔(Oryctolagus cuniculus)脾成纤维细胞进行原代建系培养并对其进行生物学特性分析，通过生长曲线测定发现该成纤维细胞在P67的最大增殖细胞数量为1.5×10⁴个(罗怡琳等2019)。乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞经冷冻复苏后细胞的存活率相对较好，与穆瑶等(2019)对中华鼢鼠(Eospalax fontanierii)成纤维细胞存活率的研究结果相近。郭晓楠(2021)对狍狍成纤维细胞复苏后存活率的研究结果则略低于本研究，且不同代次狍狍成纤维细胞复苏后细胞存活率存在显著性差异，甚至于细胞复苏后的存活率低至13%。根据比较分析可知，乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞的存活率较强，耐受冷冻性强，适合冷冻保存。
染色体核型的制备前期需要用秋水仙素对细胞进行处理，以获得更多处于中期分裂相的细胞，而处理时间以及后续实验中对细胞的低渗时间需要根据细胞的类型及生长状况而定(于漾等2014，卢文亮等2021)，秋水仙素处理时间长短会直接影响染色体的形态，若处理时间太长，得到的染色体会呈现短粗型，低渗时间若太长会导致细胞破裂，制备得到的染色体大概率会出现丢失的情况(郭晓楠2021)。对阿巴嘎黑马耳组织成纤维细胞的染色体核型研究得到其染色体条数为2n=64(王爱虹等2013)；对阿拉伯马成纤维细胞的染色体核型研究得到染色体条数为2n=64(张静南等2011)；采用外周血淋巴细胞短期培养方法，对蒙古马染色体进行了核型分析，其二倍体细胞染色体数为2n=64(晁玉庆等1992)。本实验中乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞染色体条数为2n=64，且据统计结果显示雄性、雌性乌珠穆沁白马耳组织细胞染色体中2n=64的比例占80%、85%，表明此研究培养得到的乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞可稳定遗传且具有良好的状态。
通过组织贴壁培养得到的乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞，经过多项生物学特性分析可知，细胞具有良好的形态结构，纯度高、增殖能力强，并且具有遗传稳定性，可对其进一步进行深入研究。
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