耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌生长曲线测定及对线虫毒力作用（三）
2.4线虫生存曲线
在没有抗生素存在的情况下，用携带不同耐药基因的菌株感染线虫后，绘制线虫的生存曲线(图5)，采用Log-rank检验法对组间数据进行差异显著性分析，与对照组(中位生存时间为9 d)相比，blaKPC组、blaKPC+blaNDM组和blaIMP+blaOXA组的生存曲线右移，中位生存时间为10 d，菌株对线虫的毒力作用减弱(P=0.009 2、0.022、0.001 7);blaIMP+blaNDM组生存曲线左移，中位生存时间为8 d，表明菌株对线虫的毒力作用增强，差异具有统计学意义(P=0.0064);其余各组中位生存时间为9 d，与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，菌株毒力未表现出增强或减弱。
图5耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对线虫毒力作用比较
3讨论
CRKP作为目前临床耐碳青霉烯类肠杆菌科(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)感染的主要病原菌，是临床感染的治疗与控制面临的重大挑战。本研究通过细菌生长曲线及线虫毒力模型，探究携带不同碳青霉烯类耐药基因的CRKP菌株对环境的适应性和对线虫毒力作用的影响，阐述不同碳青霉烯类耐药基因的潜在风险，补充我国CRKP的分子流行特征，为CRKP的爆发流行和感染控制提供理论依据。
本研究通过在不同浓度抗生素压力下测试各菌株的生长曲线来研究耐药基因对CRKP适应性的影响。结果显示，携带有blaKPC和blaKPC+blaNDM抗性基因的菌株，在没有抗生素的情况下生长速度与其他组没有明显差异;在抗生素存在的情况下，尤其是高浓度抗生素(8 mg/mL)下，生长速度明显高于其他组，说明携带blaKPC和blaKPC+blaNDM抗性基因的菌株在抗生素环境中适应性更强，这或许是由于其对抗生素的耐受、水解能力增强，将有助于其在抗性环境中增殖与传播。而携带blaOXA的菌株，在高浓度抗生素存在的情况下，生长明显被抑制，这可能是由于其对亚胺培南的水解作用较弱所导致的。所以携带不同的耐药基因会产生不同的适应性效应，在菌株的生长速度和细菌总量上体现出不同的效果。携带blaKPC和blaKPC+blaNDM的菌株在抗生素环境中表现出的较强种群生长增殖能力，使得他们更为广泛传播，而携带其他耐药基因的菌株在高浓度抗生素下生长较弱，所以只是零星爆发。
本研究通过线虫侵染模型探究不同碳青霉烯类耐药基因对菌株毒力的影响。结果显示，在没有抗生素的情况，携带blaKPC、blaKPC+blaNDM和blaIMP+blaOXA耐药基因的菌株感染线虫后，线虫中位生存时间较其他组有所延长，说明对线虫的毒力作用相较于其他菌株更低，而D′Apolito、McLaughlin等的研究结果也表明携带blaKPC会使菌株毒力降低，本文研究结果与其一致。虽然毒力减弱或许更利于临床感染的控制与治疗，但是随着近年来的高毒力耐药株被报道，携带blaKPC的耐药株的毒力作用也在逐渐增强，高毒力耐药株的出现也将为临床带来新的挑战。在感染blaNDM+blaIMP菌株后，线虫中位生存时间有所缩短，说明其毒力作用增强了。携带blaNDM、blaIMP、blaOXA、blaNDM+blaOXA与对照组相比差异无统计学意义，说明菌株毒力并没有表现出增强或者减低。Göttig和Liu等研究结果表明携带blaNDM并不会增强菌株的毒力，Jia等的研究结果表明其为低毒力菌株，本研究结果与其一致。而携带blaKPC的菌株毒力强于blaOXA菌株这一点在本研究中并没有得到证实，与Mil-Homens等的研究结果有差异。
碳青霉烯类耐药基因一般位于大型质粒上，由于质粒之间存在相互作用，所以携带单个耐药质粒与携带多个耐药质粒所带来的适应性和毒力作用不同。在细菌生长曲线测试结果可以看出，携带多个耐药质粒最终对细菌适应性的影响似乎有加乘效应。在抗生素存在时，单独携带blaKPC或blaNDM的菌株生长适应性都较强，同时携带blaKPC和blaNDM的菌株表现出了强于单独携带时的适应性。而且在blaIMP和blaOXA组也能观察到相似的效应:同时携带blaIMP和blaOXA的菌株比单独携带blaIMP或blaOXA的菌株表现出了更强的适应性，生长速度和细菌总量明显高于单独携带的菌株。但是在线虫毒力模型中，携带双抗性质粒的菌株，毒力作用的改变并不是两个耐药质粒毒力作用的简单加乘或拮抗效果，由于本研究涉及样本量较小，双耐药质粒对毒力作用的影响规律和作用机制还需要更进一步研究。
值得注意的是，结合耐药基因与ST分型数据，本研究发现在本研究中所有ST11型菌株都恰好携带了blaKPC抗性基因。携带blaKPC基因所带来的低毒力效应及高浓度抗生素压力下的强适应性、强增殖能力，可能正是导致ST11型菌株成为我国CRKP的主要流行克隆株。
适合度代价是指在没有选择压力的情况下，携带耐药质粒的菌株相较于没有该质粒的菌株表现出来的生长缓慢、竞争力减弱和(或)毒力减低等现象。本研究发现无抗生素时，blaKPC组和blaKPC+blaNDM组菌株对线虫的毒力作用有所降低，说明这两组菌株可能存在一定的适合度代价。这可能是由于获得耐药质粒为宿主菌带来了额外的DNA复制负担，从而对细菌细胞的复制速率产生了负面影响，生长增殖速度降低;菌株在提高环境适应性的同时，通过降低自身毒力，以减轻宿主菌的代谢负担，利于菌株的增殖与传播。在选择压力存在的条件下，携带有耐药质粒的菌株优势就得以彰显，将会表现出更高的环境适应性和更强的抗生素耐受能力。本研究中这两组菌株在抗生素存在时显示出明显的生长优势，也印证了适应性代价的存在。Li等研究也证实了blaKPC基因的表达会带来适应性代价，对菌株产生负面影响。对于blaKPC+blaNDM双抗性菌株，临床报道并不多，在Gao等研究中，利用大肠杆菌EC600作为受体菌，获得的双抗性转化株并不存在适应性代价，与本研究所采用双抗性原始分离株进行测试的结果不符，这可能是因为耐药质粒存在宿主菌依赖性。Di等研究表明blaKPC在CRKP和在E.Coli中的适应度成本不一样，说明质粒-宿主菌的相互作用是特异性的，不同遗传背景的宿主菌基因表达会影响质粒基因的表达，这或许可以解释为什么本研究中blaKPC+blaNDM双抗性菌株存在适应性代价，而Gao等的研究中却有不一样的结果。
4结论
携带不同的碳青霉烯类耐药基因会对CRKP菌群产生不同的适应性影响和毒力作用。了解临床分离株的耐药基因携带情况及既往抗生素使用史，有助于了解菌群的生长增殖状态和毒力情况，从而更有针对性的选择抗生素，并在不同的时间节点上调整抗生素用量，更好的控制感染。
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