草鱼呼肠孤病毒培养与滴度测定、及在草鱼、CIK细胞上的生长特性研究（一）
草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国的主要淡水养殖品种。然而各种疾病的暴发严重阻碍了草鱼养殖业的发展，如出血性疾病、细菌性肠炎和细菌性败血症，给草鱼养殖户造成了巨大经济损失。草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）是我国第1株分离鉴定的鱼类病毒，也是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株。由其引起的草鱼出血病是草鱼养殖过程中的最大病害，死亡率高达60%以上，严重影响了草鱼养殖业的健康发展。因其危害性大、流行范围广、发病季节长，使该病一直为我国鱼类病毒病的研究重点。学者们就该病毒的流行病学、生物化学及分子生物学等进行了研究。然而国际上对GCRV的研究与哺乳动物及禽呼肠孤病毒相比还有很大差距。研究病毒在体内的复制增殖规律可进一步揭示GCRV分子致病机理，从而为该病防治奠定基础。目前对于该病尚无有效治疗方法，主要依靠疫苗预防。我国从20世纪70年代开始研究草鱼出血病疫苗，研制出的组织疫苗和细胞疫苗在生产上收到了较好效果。目前在疫苗生产过程中多使用细胞来增殖病毒。GCRV在细胞上繁殖速度较快，一般培养2～3 d即可观察到细胞病变（Cytopathological effect，CPE）。当前多使用CIK细胞来制备细胞疫苗，在病毒培养过程中多通过观察细胞病变来收获病毒。但这种方式并不能准确反映病毒在细胞中的增殖规律，往往错过最佳收获病毒时期，致使疫苗免疫效果不理想而造成经济损失。
Real-time PCR技术具有灵敏度高、操作简单、结果直观、重复性好、特异性强等优点，能够精确分析病毒在细胞中的增殖规律，从而为生产细胞苗提供依据。为此，本研究利用建立的Real-time PCR方法，对GCRV在CIK细胞及草鱼体内的增殖复制进行动态监测，从而为GCRV致病机理研究和细胞灭活疫苗制备奠定基础。
1材料与方法
1.1试剂材料
M199培养基、胰酶：Gibco公司产品；胎牛血清：购自四季青公司；M-MLV反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、T载体：购自TAKARA公司；Trizol Reagent：购于Invitrogen公司；DNA Marker：购自鼎国生物公司；SYBR Green荧光染料：购自TOYOBO公司；质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒：购自爱思进公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2细胞、毒株及试验鱼
草鱼肾细胞系CIK、GCRV873由本实验室保存。用于本研究的草鱼购自浙江省淡水水产研究所苗种基地，体重为10～15 g，分别置于4个体积约300 L自动充气水循环系统圆柱形水缸中饲养，每缸放40尾，饲养2周，水温保持（26±1）℃；试验期间每天投喂颗粒性饵料2次，投饵之前先吸污换水。
1.3 Real-time PCR检测方法的建立
1.3.1引物设计根据GenBank中GCRV 873毒株VP6蛋白编码基因序列，应用Primer 5软件设计特异性荧光定量引物VP6-U及VP6-L，同时针对草鱼内参基因β-actin序列设计特异性引物。引物序列（表1）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1 GCRV荧光定量PCR引物序列
1.3.2标准品制备收集GCRV 873毒株CIK细胞培养物，按照Trizol说明书抽提RNA；用随机引物反转录获得cDNA后，分别用引物VP6-U/VP6-L和β-actin-U/β-actin-L扩增病毒VP6基因及内参基因β-actin。反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸20 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物经回收纯化后，克隆于pMD-18T载体，并将阳性克隆送南京金斯瑞公司测序确认。对测序正确的阳性克隆抽提质粒，测定浓度，按公式计算质粒标准品的拷贝数：拷贝数=（质量/分子量）×6.02×1023。
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