工程菌大肠杆菌EcN FGF19-01培养、生长曲线测定及改善慢性结肠炎作用研究（二）
6、蛋白质提取和免疫印迹
菌体蛋白提取：取适量菌液，离心后分别收集菌液和上清培养基，在菌液中加适量体积的混有蛋白酶抑制剂和磷脂酶抑制剂的变性RIPA裂解液（150 mM NaCl、10 mM TrispH7.2、0.1%SDS、1%Triton X-100、1%Deoxycholate和5 mM EDTA），冰浴下超声破碎10s/10s，10 min后，4℃，12000 rmp离心20分钟，取上清，得到菌体蛋白溶液。
培养基上清蛋白提取：取适量培养基上清，加入4倍体积的甲醇，混合均匀后4℃静置3 h，4℃，10000 rmp离心10分钟后弃上清，收集蛋白沉淀，将沉淀的蛋白用盐酸胍乙醇溶液洗3次，20 min/次，使用含有蛋白酶抑制剂的1%SDS溶液溶解蛋白，得到培养基上清蛋白溶液。
Western blot：用Pierce公司的BCA Kit测蛋白浓度。测完浓度后，加5×SDSloading buffer（200 mM Tris-Cl、pH6.8、8%SDS、0.4%溴酚蓝、40%甘油和400 mMDTT），100℃煮10分钟，立即上样进行免疫印迹检测或-20℃贮存备用。
选用10%的不连续变性聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE）进行垂直电泳，开始以80伏的电压进行电泳，待染料前沿进入分离胶后将电压提高到120伏继续电泳，直到溴酚蓝到达分离胶的底部（10×电泳液：Tris 30 g、Glycine 144 g、SDS 10 g，加ddH2O到1 L）。PVDF膜用甲醇泡15 sec，和胶一起放入转膜缓冲液中平衡15 min（10×转膜缓冲液：Tris 30 g、Glycine 144 g、甲醇200 ml，加水到1 L）；然后按照阳极－海绵－滤纸－PVDF膜－胶－滤纸－海绵－阴极的顺序安置好，放入转膜容器中，4℃，380 mA，转膜时间根据分子量不同而不同，一般为1-2 h。转膜结束后取出PVDF膜，标好方向和marker，按需裁剪。用10%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗三次，每次10 min（10×TBS：24.2 g Tris、80 g NaCl，用浓HCl调pH到7.6；TBST：1×TBS和0.1%Tween-20）。进行一抗反应，抗体配置在1×TBST＋5%BSA中，室温1-2小时或4℃过夜，回收抗体，4℃保存。PVDF膜接下来继续用TBST洗三次，每次10 min，进行二抗反应，室温一小时后TBST洗膜三次，每次10 min。ECL(AmershamBiosciences)显影。anti-FGF19和anti-GAPDH一抗抗体均购自Cell SignalingTechnology公司。结果显示，在无氧条件下EcN FGF19-01菌株显著高表达FGF19蛋白。
7、Elisa试剂盒测定FGF19蛋白含量
细菌上清液FGF19含量测定：细菌经37度水浴解冻活化后，1:100接种后过夜摇菌，第二天1:100接种到EP管中，在厌氧条件下振荡培养，分别在0、2、4、6、8、10和12h时收集培养基，离心后取上清液，按照Elisa试剂盒（proteintech，Human FGF19 ELISA Kit，KE00243）说明书测标准品及菌液上清的FGF19蛋白含量。结果显示，EcN FGF19-01能够分泌FGF19蛋白至培养基上清中，且在6h时分泌量最高（超过8 ng/ml）。
8、工程菌EcN FGF19-01微胶囊的制备
微胶囊是由藻酸盐-多聚赖氨酸-藻酸盐组成的，其制备步骤如下：1）设备连接。反应容器中注入225 ml的无菌聚合缓冲液，然后将其固定在工作台上的微胶囊造粒仪控制单元上，并在控制单元上设置参数（振动频率为1300Hz，电压为1100v，转速为75 rmp）；2）细菌收集。5x109 CFU/mL的EcN FGF19和野生型EcN菌液各20 mL，离心后弃上清，并用PBS洗两遍后离心收集菌体在50 mL的离心管中。收集好的菌液用1mL无菌的MPOS（3-吗啉丙磺酸）清洗缓冲液进行重悬，然后加入20 mL1.5%的海藻酸钠溶液混合形成细胞-藻酸盐悬浮液；3）液珠固化。细胞-藻酸盐悬浮液转移至20 mL注射器中，并将其连接到层流空气罩中的反应容器中，然后推动注射器，悬浮液随即进入喷嘴，使用设定的参数使由喷嘴喷出的液滴快速分散开并进入聚合溶液中，搅拌使液珠成形；4）藻酸隔膜形成。
在液珠固化5 min后，停止搅拌并排净聚合溶液，然后加入75 mL 0.1%多聚赖氨酸溶液搅拌10 min；5）清洗。排净0.05%多聚赖氨酸溶液之后，第一次清洗即加入200 mL MPOS清洗溶液搅拌1min后排净，然后进行第二次清洗即加入200 mL MPOS清洗溶液搅拌5 min后排净；6）外部藻酸盐隔膜形成。加入100 mL 0.03%藻酸盐溶液，搅拌5 min后形成外部藻酸盐隔膜，然后排净藻酸盐溶液；7）清洗。加入200 mL MPOS清洗溶液搅拌1min后排净；8）解聚。加入200 ml解聚合溶液搅拌约10min使液珠芯材的藻酸盐溶解，然后排净解聚合溶液；9）胶囊收集。加入200 mL MPOS清洗溶液，重新悬浮胶囊并传送至收集瓶进行收集。微胶囊分别命名为EcN FGF19-01和EcN WT。
9、实验动物处理
野生型雄性C57BL/6小鼠购于上海斯莱克实验动物中心。小鼠适应7天后，开始给予含Abx的饮用水，5天后换为正常饮水，称体重后，将小鼠分为体重相当的3组，实验组开始饮用3.5%DSS水溶液，并开始分别灌胃有活性的EcN FGF19-01菌和EcN WT菌（1*109 CFU/小鼠），或分别灌胃EcN FGF19-01和EcN WT微胶囊，每只小鼠灌胃200μL菌液或微胶囊，每天灌胃1次，持续1周。实验过程中每天称小鼠体重，并进行腹泻评分（0-4）。小鼠养于SPF级动物房，饲养温度为25℃昼夜12小时循环，实验开始之前给予符合国际标准的食物及饮水饲养。实验结束后小鼠用二氧化碳处死，收集各种组织，液氮冷冻后放入-80℃冰箱保存备用。结果显示，灌胃工程化大肠杆菌EcN FGF19-01或包裹EcN FGF19-01的微胶囊均够显著改善结肠炎小鼠体重、降低腹泻指数和肠道黏膜损伤。
10、组织学分析和评分
伊红和苏木素（Hematoxylin and eosin,H＆amp;E）染色采用标准步骤进行，对肠道形态进行组织学分析，然后对肠道受损情况进行双盲评分。
11、统计分析
数值均以均值±标准误表示。两组间差别是否具有统计学意义采用非配对组间双尾t检验进行检测，两组以上统计采用one-way或two-way ANOVA分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001为具有统计学差异。
综上所述，创制一株表达分泌FGF19工程化大肠杆菌，同时探索其在改善结肠炎中应用价值。