DAPI荧光染色计数法：不同保藏方式时间对海洋微型底栖生物计数结果的影响——摘要、材料与方法
DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole,4′,6-联脒-2-苯基吲哚)是一种灵敏度高、特异性强的荧光染料,对细胞核及染色体有很好的染色效果。它可与DNA的A-T碱基结合形成DAPI-DNA复合物,该复合物在紫外激发光(365nm)下会发出蓝色荧光。而福尔马林固定的样品经DAPI染色时,甲醛可诱发蛋白质中的芳香乙胺基团转化为荧光色团,从而使细胞质荧光较强,由此可见整个细胞的轮廓。此外,细胞内的色素体在绿色激发光下发出红色荧光,可计数自养鞭毛虫。由此,DAPI不仅用于细菌计数,也可用于蓝细菌、硅藻、自养和异养小鞭毛虫及纤毛虫等微型底栖生物计数。结合复染剂Evans Blue的使用,可使染色后的细胞更容易辨认。
样品的保藏方式及保存时间是影响DAPI荧光计数效能的重要因素。对海洋浮游细菌及鞭毛虫的研究发现,固定后的样品随着保藏时间延长,可造成数量低估。Daley等、Sherr等及Kepner等发现经福尔马林固定的浮游样品于5℃下避光保存1～3周后,对细菌的计数结果无差异。Porter等报道福尔马林固定的浮游样品经DAPI染色后封片,4℃下保存24周对细菌的计数结果无差异。但Hyun等报道经福尔马林固定后的浮游样品,贮藏于样品瓶的计数结果优于封片保存的。Turley等用戊二醛固定浮游样品并经常温避光保藏,40天后发现对细菌的计数数量平均减少了39%,而经DAPI染色封片并冷冻保存70 d的细菌计数则无影响。而Pomroy发现经过Lugol’s液固定的浮游样品在室温避光保存4年未造成对细菌数量的低估,对鞭毛虫可保存10年甚至更长而无数量变化。但是,上述研究均源自浮游样品,对于底栖样品则缺少系统的研究。仅Hamels等报道沉积物中的鞭毛虫经DAPI染色封片后可冷冻避光保存1个月,而经Percoll液提取后的鞭毛虫经同样处理可保存2个月。
由于细菌及原生生物因可附着于其他生物体和/或沉积物颗粒表面(如“海雪”),若不加处理直接以DAPI进行荧光计数,可对其数量乃重要性造成不同程度的低估。目前最为有效的做法是首先利用超声波等设备将底栖生物与沉积物分散开,然后再行染色计数。但在野外尤其是海上取样时,因取样站位多、时间紧、超声波分散仪及离心设备等现场无法使用,将样品进行保藏(冷冻或冷藏)后带回室内分析是较为可行的方法。保藏方式对于无细胞壁的原生生物尤为重要,如在冷冻保藏的冻融过程中,可因细胞膜的破裂而无法准确计数。此外,出海采集常涉及大量样品,样品分析完成常需数周甚至数月。因此,测试不同保藏方式和保存时间对沉积物样品定量分析的影响,是对数量进行准确估算的重要环节。
作者采用DAPI荧光染色计数法对海洋沉积物样品中的细菌、蓝细菌、自养小鞭毛虫(PNF)和异养小鞭毛虫(HNF)及硅藻进行了冷藏与冷冻两种保藏方式的比较分析,同时比较研究了不同保藏时间(1个月和4个月)对这些微型底栖生物计数结果的影响。
1材料与方法
1.1研究站位和样品采集
用内径1.6 cm的采样管(注射器改造),从未受扰动的0.1 m2改进型Gray-Ohara箱式采泥器中,随机采集5 cm长芯样4个,每个芯样按0～2 cm、2～5 cm分层移入50 mL离心管中,加入经滤膜(孔径0.22µm)过滤的海水配制的2.5%甲醛溶液分别至20 mL和30 mL进行固定。每个重复各取10 mL后合并共计40 mL,一份于4℃避光冷藏保存,一份放置在冰柜-20℃避光冷冻保存。
冷冻和冷藏对比实验选取2007年7月采集自黄海的编号为3205(32°N,124.5°E)、3403(33.5°N,123°E)、4018(33°N,122.5°E)三个站位的0～2 cm分层样品;保存时间实验选取2008年开放共享航次编号为3400-8(34°N,124°E)、3800-1(38°N,121.7°E)两个站位的0～2 cm、2～5 cm分层的样品(图1)。沉积物粒度分析采用Cilas(940L)型激光粒度仪进行测定。其他环境资料来自温盐深测定仪(CTD)现场测定。
图1黄海采样站位
1.2样品分析方法
取适量样品(约2mL)加入焦磷酸四钠(f.c.1 mmol/L),常温避光培育15～30 min。经JY92-II超声波分散处理180 s(振幅109μm,50 W,6 mm Microtip),为避免样品过热,每超声破碎处理45 s,冷却1 min。取分样后,根据镜检样品中生物的密度,调节至适当的稀释倍率(细菌以每个视野20～30个为宜,鞭毛虫以沉积物不遮挡生物为宜),加入DAPI(f.c.5 mg/L)和复染剂Evans Blue(f.c.10-6g/mL),低温避光染色10 min。染色样品经Sartorius真空过滤系统浓缩过滤到黑混合纤维素膜上。封片后置于Zeiss Axioskop 2 plus HBO 100荧光显微镜油镜下镜检计数。细菌的计数在紫外光激发(BP 365/12,FT 395,LP 397)下,每片随机计数20～40个视野,总计500个左右。鞭毛虫的计数根据其最长粒径划分为2～5µm,5～10µm,＞10µm三个粒级,先在紫外激发光下每片随机计数50个视野(此为鞭毛虫总数),后转换至绿色激发光(BP 546/12,FT 580,LP 59)下,每片快速随机计数50个视野(为自养小鞭毛虫(PNF)总数)。异养小鞭毛虫(HNF)的数目为鞭毛虫总数与自养小鞭毛虫数目的差值。根据视野面积以及样品稀释倍率换算各生物类群的最终丰度。微型底栖生物丰度的计算按如下公式：
A=(N/Sf)SD/V
其中,A为丰度(个/mL);N为各视野平均数(个);Sf为1000×下显微镜视野面积(cm2);S为滤膜实际过滤面积(cm2);D为稀释倍数;V为染色用的样品体积(mL)。
文中采用如下缩写：自养小鞭毛虫PNF(2～5µm)、PNF(5～10µm)、PNF(＞10µm);异养小鞭毛虫HNF(2～5µm)、HNF(5～10µm)、HNF(＞10µm)。
1.3数据统计分析
采用SPSS 15.0统计软件进行分析,将沉积物中各类群丰度的不同处理进行T-test检验。为使数据正态分布,将原始数据经过log转化处理。
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