铁皮、叠鞘石斛提取物对沙门氏菌生长状况、群体运动的影响——结论与讨论、结论
3 结论与讨论
3.1 石斛提取物对沙门氏菌的MIC
测定2种石斛提取物的MIC,确定后续实验浓度在亚抑菌浓度梯度下进行,确保沙门氏菌的QS抑制效果不是由抑菌效果导致。由图1可知,铁皮石斛提取物对沙门氏菌的MIC为8 mg/mL。叠鞘石斛提取物的MIC为4 mg/mL。
图1 两种石斛提取物对沙门氏菌的MIC
3.2 石斛提取物对沙门氏菌生长状况的影响
生长曲线主要包括微生物生长的4个时期:迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。微生物在对数期的生长速度最大,在此期间内大量生长繁殖。通过对比添加组与未添加组的曲线一致情况,可得知添加物对沙门氏菌生长繁殖情况的影响程度。由图2可知,加入亚抑菌浓度的石斛提取物组和未加提取物组的生长曲线几乎完全重合,说明亚抑菌浓度下的石斛提取物对沙门氏菌的生长繁殖没有影响。
a-铁皮石斛提取物组;b-叠鞘石斛提取物组
图2 两种石斛提取物对沙门氏菌生长状况的影响
3.3 石斛提取物对沙门氏菌运动能力的影响
泳动是细菌迁移的一种重要方式,是指细菌在琼脂含量<0.45%的培养基表面迁移。沙门氏菌的泳动能力可通过细菌在泳动平板上从接种点向四周扩散且迁移直径表征。细菌的泳动能力有利于细菌生物膜形成和细菌在宿主表面黏附聚集。如图3和图4所示,当加入石斛提取物后,细菌的迁移直径明显缩小,且呈现出剂量依赖性。由表1可知,当铁皮石斛提取物的质量浓度为8 mg/mL时,对沙门氏菌群集运动的抑制率为91.33%;当叠鞘石斛提取物的质量浓度为4 mg/mL时,对沙门氏菌群集运动的抑制能力达到了48.67%。实验过程中发现石斛提取物由于含有多糖,会随着浓度增高使培养基黏稠度变大,用0.22 μm滤膜过滤后可以消除多糖对实验结果的影响。
表1 两种石斛提取物对沙门氏菌群集运动的抑制能力
图3 叠鞘石斛提取物对沙门氏菌群集运动的影响
图4 铁皮石斛提取物对沙门氏菌群集运动的影响
3.4 石斛提取物对沙门氏菌生物膜形成的影响
生物膜是细菌在生长过程中吸附于生长基质表面形成的一种包裹在细菌外面的生物被膜,由菌体和自身分泌的细胞外基质构成。生物膜形成有利于细菌生长及抗逆性产生。刘旭的实验表明沙门氏菌生物膜的形成在该病原菌的传播和感染过程中发挥重要作用。由图5可知,2种石斛提取物均抑制沙门氏菌生物膜形成(P<0.01),并且生物膜生长率与石斛提取物浓度呈现负相关。
图5 两种石斛提取物对沙门氏菌生物膜生成率的影响
注:与对照组相比,***表示P<0.01。
3.5 石斛提取物成分分析
植物提取物中的黄酮类、多酚类、香豆素类、生物碱类等成分均存在抗菌活性,因其结构和组成差异发挥不同的QS抑制活性。图6和图7中结果表明,在石斛提取物中共鉴定出3种成分:异鼠李素,金丝桃苷,槲皮素。这些成分均具有抗菌、抗生物膜、抑制QS等多种作用。
a-异鼠李素的出峰时间;b-金丝桃苷的出峰时间;c-槲皮素的出峰时间
图6 单体标准物质的出峰时间
a-铁皮石斛提取物;b-叠鞘石斛提取物
图7 提取物的HPLC图
3.6 分子对接结果
据研究报道,异鼠李素、金丝桃苷、槲皮素等成分均具有QSI活性。根据HPLC的结果,选择异鼠李素、金丝桃苷和槲皮素这3种成分进行分子模拟对接,分析石斛提取物发挥QSI活性的可能机制。结果显示,异鼠李素、金丝桃苷、槲皮素均能与LuxS受体蛋白结合,对接分数分别为-8、-9.1、-8,对应的结合能为-5.5、-2.57、-5.53 kJ/mol。结合能越小,说明对接能力越强。异鼠李素与LuxS受体的Asn124之间形成氢键,金丝桃苷与Cys41、Ile142和Asp141之间形成了氢键,槲皮素与受体的Gln127和Leu123之间形成了氢键。分子对接结果如图8所示。
a-异鼠李素与LuxS蛋白对接;b-金丝桃苷与LuxS蛋白对接;c-槲皮素与LuxS蛋白对接
图8 分子对接结果
4 结论
通过生长曲线实验、泳动实验、生物膜实验可知石斛提取物具有明显抑制沙门氏菌群体行为的作用,且这种抑制作用具有统计学意义(P<0.05),说明石斛提取物可以对沙门氏菌的运动能力和耐药性造成明显影响。经HPLC分析表明,铁皮石斛提取物和叠鞘石斛提取物均含有异鼠李素、金丝桃苷和槲皮素这3种单体成分,分子对接结果表明,石斛提取物的活性单体成分均可与LuxS蛋白进行结合,提示石斛提取物可以通过与信号分子竞争沙门氏菌的QS系统受体蛋白来抑制沙门氏菌致病基因表达从而达到抑制细菌运动能力和抗性的作用。
通过以上实验,本研究发现石斛提取物对沙门氏菌的QS系统可以产生影响,其作用机制可能是通过抑制沙门氏菌的QS系统受体蛋白来抑制沙门氏菌致病基因表达,从而达到抑制沙门氏菌致病侵袭能力的效果。本研究可为铁皮石斛和叠鞘石斛的功效开发以及沙门氏菌的新型抑菌剂开发提供研究方向。
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