牛源解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶活力测定、抗逆性及药敏试验（三）
2.6体外抑菌试验结果
菌株GXUN13068-1体外抑菌试验结果见表5。菌株GXUN13068-1的发酵液、菌悬液对3种致病菌均具有抑菌活性，上清液只对结核杆菌具有抑菌活性，其中菌株GXUN13068-1发酵液对结核杆菌的抑制效果最为明显，圈径比高达2.6以上。从体外抑菌试验结果可看出菌悬液和发酵液对病原菌的抑制效果较上清液明显，由此可以判断出GXUN13068-1的抑菌作用主要依赖于菌体本身。
表5菌株GXUN13068-1对不同病原指示菌的抑菌活性
2.7溶血活性试验结果
金黄色葡萄球菌和菌株GXUN13068-1在哥伦比亚血琼脂培养基上的生长形态如图7所示，金黄色葡萄球菌在培养基上出现界限分明，有完全透明的β溶血圈(图7-a)，而菌株GXUN13068-1在培养基上无溶血圈(图7-b)，说明菌株GXUN13068-1无溶血活性。
图7菌株GXUN13068-1的溶血活性
2.8全基因组测序分析
2.8.1测序与组装结果分析
通过对菌株GXUN13068-1进行测序评估和组装，拼接得到菌株GXUN13068-1的基因组环状图谱(图8)，该菌株全长4 070 064 bp，有2个重叠群(contigs)，GC含量为46.46%，共有3 883个蛋白质编码序列(CDS)，30个核糖体RNA(rRNA)、93个转运RNA(tRNA)和1个转运-信使RNA(tmRNA)被注释。
图8菌株GXUN13068-1的基因组环状图谱CDS:蛋白质编码序列coding sequence;tRNA:转运RNA transfer RNA;rRNA:核糖体RNA ribosomal RNA;Other:其他;GC content:GC含量;GC skew+:G含量大于C含量the G content is greater than the C content;GC skew-:G含量小于C含量the G content is less than the C content。
2.8.2基因组功能注释及预测
2.8.2.1 GO数据库注释结果
菌株GXUN13068-1在GO数据库分析中共有32 654个基因被注释(图9)，其中属于生物学过程(biological process，BP)的有21 809个，占比66.79%;属于细胞组分(cellular component，CC)的有47 42个，占比14.52%;属于分子功能(molecular function，MF)的优6 103个，占比18.69%。在生物学过程中，与代谢相关的基因最多，包括代谢过程(577个基因)、细胞过程(577个基因)、有机物代谢过程(522个基因)等;在细胞组分中，主要与细胞(611个基因)、细胞部件(611个基因)、细胞内(363个基因)等有关;在分子功能上，主要与催化活性(501个基因)、结合(224个基因)、转移酶活性(188个基因)等有关。同时，还注释到抗逆性基因，如制孢调控(GO:0043937)、产孢(GO:0030435)等。上述结果表明，菌株GXUN13068-1具有较强的代谢能力及环境适应能力。
图9菌株GXUN13068-1基因组GO功能分类
2.8.2.2 CAZy数据库注释结果
将菌株GXUN13068-1基因组与CAZy数据库进行比对，结果(图10)显示有55个基因被成功注释，其中最多的是糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GH)基因(25个)，随后依次为糖基转移酶(glycosyl transferases，GT)基因(23个)、碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding modules，CBM)基因(5个)、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，CE)基因(1个)和辅助氧化还原酶基因(auxiliary activities，AA)(1个)。在注释到的基因中，编码纤维素酶的基因(GH5家族)有2个，编码淀粉酶的基因(GH13家族)有6个，编码木聚糖酶的基因(GH43家族)有4个，编码糖基水解酶的基因(GH32家族)有3个。由此可知，菌株GXUN13068-1具有较强的碳水化合物水解能力。
图10菌株GXUN13068-1基因组CAZy功能分类GT:糖基转移酶glycosyl transferases;GH:糖苷水解酶glycoside hydrolases;CBMs碳水化合物结合模块carbohydrate-binding modules;CE:碳水化合物酯酶carbohydrate esterases;AA:辅助氧化还原酶auxiliary activities。
2.8.2.3毒力基因注释结果
将菌株GXUN13068-1基因组与VFDB数据库进行比对，筛选一致性(identity)≥70%的基因，共找到7个毒力基因，如表6所示，其中2个基因与应激生存有关，2个基因与黏附有关，2个基因与免疫调控有关，1个基因与营养代谢因子有关，无可移动毒力基因，无致病性有关基因。
表6菌株GXUN13068-1注释到的毒力基因
2.8.2.4耐药基因注释结果
将菌株GXUN13068-1基因组与CARD数据库进行比对，筛选identity≥80%的基因，共找到2个耐药基因——EmrB与GdnD，无可移动耐药基因。EmrB属于ATP结合盒抗生素外排泵(ATP-binding cassette antibiotic efflux pump)基因家族，对林可胺类抗生素具有抗性。GdnD属于小多药耐药抗生素外排泵(small multidrug resistance antibiotic efflux pump)基因家族，对氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、酚类抗生素具有抗性。
3讨论
从动物肠道微生物中筛选益生菌株并将其作为饲用益生菌添加到动物饲粮中，是一种常用并且高效的益生菌资源开发利用途径。哺乳动物不能自身产生纤维素酶，所需纤维素酶是由胃肠道微生物产生，因此草食动物的粪便是筛选产纤维素酶菌的重要来源，而芽孢杆菌的高抗逆性和高产纤维素酶量使其成为纤维素降解菌研究中的重要菌种。例如，田思齐等从大熊猫粪便中筛选到2株枯草芽孢杆菌，所产纤维素酶活力分别高达339.48和293.65 U/mL;姜立春等从麦洼牦牛粪便中分离出1株溶杆菌，所产纤维素酶活力为11.88 U/mL。本试验从牛粪便中筛选出的菌株GXUN13068-1为解淀粉芽孢杆菌，所产纤维素酶最高活力可达126.37 U/mL，产酶效果相对比较理想。
肠道中有益菌增殖有利于提高动物健康和生产力。Wu等研究发现，饲料中添加复合益生菌对提高锦鲤抗氧化能力、血浆生化参数以及肠道形态和微生物群有正向影响，提高了锦鲤的生长性能。Jadamus等研究发现，饲粮中添加枯草芽孢杆菌能显著提高肉鸡的生长性能，且对肉鸡的肠道菌群产生了有益影响。Markowiak等综合分析后认为，饲粮中添加单一益生菌菌剂或者复合益生菌菌剂均能促进养殖动物对饲料中养分的消化和吸收，从而促进动物体的生长。Youngblut等的研究表明，在整个进化过程中，肠道微生物群和动物宿主之间有着密切的联系。Goel等的研究表明，肠道微生物群和膳食因子之间的相互作用产生了纤维素水解酶，这有助于木质纤维素的降解。反刍动物的肠道内存在多样性厌氧菌，对纤维素具有良好的降解能力。肠道菌群通过促进营养供应、消化和吸收，提高动物的生长性能，减少病原体定植，并维持正常的黏膜免疫，兼具有代谢、营养和防御作用。而从动物粪便中分离出的菌株来源于动物本身，能较好地适应动物体内胃肠道环境，容易定植。
芽孢杆菌作为具有广谱杆菌活性的革兰氏阳性菌，能产生细菌素抑制病原微生物。于秀菊等从羊驼肠道中分离出1株地衣芽孢杆菌，该菌株对金黄色葡萄球菌等3种致病菌具有显著抑制效果，并能改善小鼠肠道形态，提高了鼠肠道益生菌相对丰度。朱静静等从加州鲈肠道中分离出1株枯草芽孢杆菌，该菌株具有拮抗诺卡氏菌的效果，并促进了加州鲈的生长，减少加州鲈肠道炎症的发生。本试验从牛粪便中分离出的1株解淀粉芽孢杆菌对大肠杆菌等肠道病原菌具有抑制作用，表明此菌株具有作为微生物饲料添加剂代替抗生素使用的潜能。
耐药基因和毒力基因注释结果显示，菌株GXUN13068-1仅有2个耐药基因，无可移动耐药基因及毒力基因，无致病性基因，与其他具有潜在毒力的基因相似度低于80%。因此，可以认为菌株GXUN13068-1具有较高的安全性。此外，通过与GO数据库比对，发现菌株GXUN13068-1含有多个抗逆性基因，为其耐受人工胃液和人工肠液提供了依据，表明菌株GXUN13068-1具有很强的环境适应能力及代谢能力;通过与CAZy数据库比对，发现菌株GXUN13068-1含有多种水解酶，能够水解纤维素、木聚糖、淀粉等多种碳水化合物，具有较高的碳水化合物水解能力。
4结论
本试验从牛粪便中分离出1株高产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌，该菌株对胃肠道环境具有良好的耐受能力，没有溶血性，对大部分抗生素敏感，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌具有明显的抑菌效果，无可移动耐药基因及毒力基因，无致病性基因，具有成为饲用益生菌的潜力。
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