乌梅等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌活性研究【药敏试验】（一）
【目的】观察乌梅Fructus mume等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通过乙醇回流、水煎煮和超声波等方法对20种中药进行提取，采用二倍稀释法测定其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性;并研究抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌活性.【结果和结论】乌梅、黄连Rhizoma coptidis、诃子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)范围是6.25～50.00 mg/mL;大青叶Isatis indigotica、茵陈Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鲜皮Dictamnus dasycarpus 4种中药提取物的MIC范围是50.00～100.00 mg/mL;黄柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金银花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板蓝根Baphicacanthus cusia、栀子Gardenia jasminoides和黄芪Astragalus membranaceus等10种中药提取物的MIC＞100.00 mg/mL.联合抑菌试验结果表明，乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合抑菌指数(FICI)≤1，乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI＞2.乌梅、黄连、诃子、虎杖、秦皮、地榆对胸膜肺炎放线杆菌均具有较好的体外抗菌活性;乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合为相加、协同作用;秦皮分别与乌梅、虎杖为拮抗作用.
胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae属巴氏杆菌科嗜血杆菌属，后根据其表型和DNA杂交水平均与放线杆菌属模式种密切相关，归属为巴氏杆菌科放线杆菌属.常与巴氏杆菌等混合感染，是引起猪上呼吸道感染的主要病原菌之一.主要引起猪传染性胸膜肺炎，表现为急慢性炎症，急性死亡率较高，常伴随猪繁殖与呼吸综合征病毒感染，是一种高度传染性疾病.目前猪传染性胸膜肺炎的治疗主要采用抗菌药物，如氟苯尼考、盐酸环丙沙星等，大量抗菌药物的使用，增加了胸膜肺炎放线杆菌的耐药性，同时由于抗菌药物的滥用，造成药物残留和环境污染等诸多社会问题.针对抗菌药物所带来的诸多问题，兽医临床急需寻找低毒有效的抗菌药物替代品，以控制疾病的发生.据研究报道，中药或天然植物提取物，可发挥对病原菌的直接杀灭作用不产生耐药性.因此如何从中药中寻找抗胸膜肺炎放线杆菌新药已经成为药物开发的热点.本研究选择乌梅、黄连等20种具有抗菌活性的中药，提取其不同部位，研究其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性，以期为筛选得到对胸膜肺炎放线杆菌具有抗菌作用的中药及其复方奠定基础.
1材料与方法
1.1材料
乌梅Fructus mume(产地四川，批次：120315)、黄连Rhizoma coptidis(产地四川，批次：080406)、诃子Terminalia chebula(产地云南，批次：081121)、虎杖Polygonum cuspidatum(产地四川，批次：081102)、柴胡Bupleurum chinense(产地甘肃，批次：080301)、板蓝根Baphicacanthus cusia(产地甘肃，批次：080921)、黄柏Phellodendron amurense(产地四川，批次：080923)、大青叶Isatis indigotica(产地四川，批次：100310)、杜仲Eucommia ulmoides(产地云南，批次：080916)、蒲公英Taraxacum mongolicum(产地贵州，批次：100217)、白鲜皮Dictamnus dasycarpus(产地辽宁，批次：080914)、茵陈Artemisia capillaris(产地河北，批次：080923)、秦皮Cortex fraxini(产地山西，批次：100330)、栀子Gardenia jasminoides(产地广西，批次：080622)、黄芪Astragalus membranaceus(产地陕西，批次：040824)、鱼腥草Houttuynia cordata(产地四川，批次：100310)、甘草Glycyrrhiza uralensis(产地甘肃，批次：081102)、夏枯草Prunella vulgaris(产地河南，批次：101114)、地榆Sanguisorbae officinalis(产地陕西，批次：040827)、金银花Lonicera japonica(产地四川，批次：080919)20种中药均购于四川雅安惠民堂药业连锁有限责任公司，由四川农业大学药学系副教授范巧佳鉴定为正品.
胸膜肺炎放线杆菌(ATCC265)，购买于中国兽药监察所.含质量分数为0.02%烟酰胺腺嘌呤二核甘酸(NAD)的TSB液体培养基、含质量分数为0.02%NAD的TSA固体培养基.96微孔细胞培养板、SPX型生化培养箱、旋转蒸发仪、索氏提取器等.
1.2方法
1.2.1 20种中药有效部位的提取乌梅、黄连、诃子、虎杖等20种中药按文献的方法进行有效部位的提取，压缩烘干成浸膏.
1.2.2药液制备将20种中药提取物浸膏溶于二甲基亚砜中，配制成质量浓度为1 g/mL的储备液，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱保存.
1.2.3有效部位抗菌活性研究参照美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)推荐的对细菌敏感性检测方案，采用试管二倍稀释法，测定20种中药有效部位提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC);用TSA琼脂平板涂板法测定20种中药有效部位提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小杀菌浓度(Minimal bactericidal concentration，MBC).
菌液制备：采用平板菌落计数法确定菌液浓度.将胸膜肺炎放线杆菌菌液进行10倍系列稀释，分别取不同稀释度的菌液0.1 mL滴加于含质量分数为0.02%NDA的TSA平板上，用无菌涂布器涂布均匀，每稀释度重复2块平板，37℃温箱中培养18～24 h.选取菌落数在30～300个的平板进行计数，每组稀释度相同的平板取平均值作为菌落数.计算出原菌液细菌浓度，作为细菌菌液的标准浓度.
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