乌梅等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌活性研究【药敏试验】（二）
药敏试验方法：采用试管二倍稀释法.取无菌试管16支，分为试验组和对照组，每组8支.分组编号后向试验组8支试管中各加l mL TSB肉汤，以无菌操作吸取已稀释好的药物1 mL加入第1管，混匀后依次倍比稀释至第7管，混匀后自第7管弃去l mL，此时试管内药液浓度比依次为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128，相当于药液质量浓度为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.60、7.80 mg/mL，第8管不加药物为对照组管.对照组操作同试验组.用微量加样器取已校正浓度的菌液0.1 mL，依次由低浓度向高浓度加到试验组各管中，混匀后，置于37℃培养箱培养18～24 h后分别观察细菌的生长状况，以浑浊度为指标，以对照组为参考对象检查试管中有无细菌生长，以药物最低浓度管中无细菌生长者为该试验菌MIC.将MIC测定中判定未生长细菌的试验组中药肉汤1 mL涂布于TSA琼脂平板上，37℃条件培养18～24 h，观察结果，以细菌菌落个数不超5个的管内的药物浓度，为该药的MBC.
1.2.4联合抑菌活性的研究根据前期20味中药有效部位体外MIC的测定，选取其中抗菌活性较强的几味中药进行两两联合抑菌活性的研究.
溶液配制：精确称取抗菌活性较强的几种中药提取物0.20 g，溶于1 mL无菌蒸馏水中，超声仪上超声使其充分溶解，配制成质量浓度为200.00 mg/mL的药物母液，灭菌，4℃冰箱保存.
联合用药选择药物的起始浓度约为2 MIC，用TSB培养液对上述药液进行倍比稀释，使配方中提取物的初始浓度为2 MIC，终末浓度为1/64 MIC.
药敏试验：将无菌96孔板在超净台用紫外灯照射30 min，以棋盘稀释法8孔稀释.单用药物于药敏板第1孔分别向右向下倍比稀释，各8孔，每孔100μL，第1排第9孔为空白对照，第1排第10孔为生长对照.联合用药药敏板则分别在每孔依次加2种药物各50μL，向右向下2倍稀释.药物灌板后，按药敏板的布局，每孔加入100μL菌悬液.将药敏板置于微量振荡器上振荡，使其充分混匀，37℃条件下培养18～36 h，置于有水环境中保持液量.
各味中药药敏试验判定标准：参考刘忠义等介绍的判断标准，MIC＜7.80 mg/mL，为高度敏感;7.80 mg/mL＜MIC＜250.00 mg/mL，为中度敏感;MIC＞250.00 mg/mL，为不敏感.
联合用药效果评价：试验结果以联合抑菌指数(Fractiona inhibitory concentration index，FICI)来判断联合效应，表示为FICI=MIC(A)联合/MIC(A)单独+MIC(B)联合/MIC(B)单独，其中，A，B分别表示2种中药种类.
当FICI≤0.50时为协同作用;0.50＜FICI≤1.00时为相加作用;1.00＜FICI≤2.00时为无关作用;FICI＞2.00时为拮抗作用.
2结果
2.1 20种中药提取物的抗菌活性
由表1可知，20种中药有效部位提取物中体外抑菌活性最强的为黄连、诃子和乌梅3种中药，MIC均为15.60 mg/mL，其次为秦皮、地榆和虎杖3种中药，MIC为31.25 mg/mL，抗菌活性稍差的是白鲜皮、茵陈、大青叶和甘草4种中药，MIC为62.50 mg/mL，抗菌活性最差的为柴胡和夏枯草，MIC为125.00 mg/mL.由此可见，黄连、乌梅等12味中药对胸膜肺炎放线杆菌表现为中度敏感.黄柏、金银花、板蓝根等8种中药，MIC均为250.00 mg/mL，无抑菌活性，为不敏感.另外，黄连MBC为15.60 mg/mL，乌梅和虎杖MBC为31.25 mg/mL，诃子、秦皮、地榆和大青叶MBC为62.50 mg/mL，具有较强的杀菌活性，黄柏、蒲公英等13味中药MBC≥125.00 mg/mL，表现出较弱杀菌活性.因而笔者选取抗菌活性较强且报道较少的乌梅、黄连、诃子、秦皮和虎杖5味中药提取物进行后续的联合抑菌活性的研究.
2.2 5种中药提取物的联合抑菌活性
5种中药提取物两两联合的抑菌活性结果见表2，根据联合抑菌指数(FICI)评价两者的联合效应.从表2可以看出，乌梅和秦皮、秦皮和虎杖FICI＞2.00，为拮抗作用;乌梅和黄连、黄连和诃子、黄连和秦皮、诃子和虎杖及黄连和虎杖FICI≤0.50，为协同作用;乌梅和诃子、乌梅和虎杖、诃子和秦皮0.50＜FICI≤1.00，为相加作用.
表1 20种中药提取物体对胸膜肺炎放线杆菌体外抗菌活性
表2 5味中药提取物两两联合抑菌活性结果
3讨论
试验采用二倍稀释法进行胸膜肺炎放线杆菌的体外抑菌试验.由于中药成分复杂，不同提取方法对抑菌活性有很大影响，本试验主要根据文献中最佳提取工艺对中药有效部位进行提取，然后测定中药的MIC值.
据LIU等报道，氟苯尼考、头孢噻呋等化学药物对胸膜肺炎放线杆菌疗效显著，普遍用于胸膜肺炎放线杆菌的治疗，而Yoshimura等检测了16种抗菌化学药物对不同血清型胸膜肺炎放线杆菌体外抑菌活性，发现氟喹诺酮类和头孢噻呋对胸膜肺炎放线杆菌抗菌活性较好，青霉素、黏菌素等抗生素对胸膜肺炎放线杆菌效果较弱，而且不同血清型胸膜肺炎放线杆菌都对它们产生了不同程度耐药性.
本研究检测到的黄连、诃子和乌梅MIC均为15.60 mg/mL，秦皮、地榆和虎杖MIC均为31.25 mg/mL，同时，黄连、乌梅、虎杖、诃子、秦皮和地榆MBC≤62.50 mg/mL，说明了黄连、诃子和乌梅等6种中药中有效部位有较强的抑杀菌作用.据葛冰等报道，将黄芪、桑白皮、陈皮和连翘4种中药进行组方后试验，发现这些组合无毒副作用，无污染，无药物残留，超微粉碎后生物利用度高，疗效显著，临床对猪胸膜肺炎放线杆菌有特效.刘仁志等利用大蒜挥发油及其复方对胸膜肺炎放线杆菌进行体外抑菌试验，证明大蒜挥发油及其复方MIC为3.90 mg/mL，MBC为7.80 mg/mL有较强的抗菌活性.而宋波等、蔡小华等报道，黄连、乌梅、诃子、虎杖等对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎球菌等体外抑菌结果表明其MIC在7.80～250.00 mg/mL之间，为中度敏感，说明6种中药活性部位能增强对细菌的抑菌作用.本试验研究表明黄连、乌梅和诃子等6种中药对胸膜肺炎放线杆菌有较强抗菌作用，为后续药物研究开发提供基础.
联合抑菌试验显示，黄连与乌梅、秦皮、诃子、虎杖联合都产生协同作用，具有良好的抗菌作用.但由于黄连主要成分为盐酸小檗碱，在配伍时能与大多数中药形成沉淀，影响抗菌活性，同时由于诃子含有大量鞣质，在进行体外抑菌试验时也会出现沉淀，影响试验结果观察.因此，在进行含有黄连和诃子的相关试验中应优化提取工艺，以减少沉淀的产生.而在联合抑菌试验中，秦皮与乌梅、虎杖都呈拮抗作用，具体作用机制有待进一步验证.
本研究表明，黄连、乌梅、诃子、虎杖、秦皮等中药对胸膜肺炎放线杆菌具有较好的抗菌活性，黄连和乌梅、虎杖以及诃子呈协同或相加作用，研究结果为筛选治疗胸膜肺炎放线杆菌病中药新药具有重要意义.
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